白头翁皂苷提取物PSD抗日本血吸虫和曼氏血吸虫的药效研究

摘要

第一部分 PSD抗日本血吸虫活性的研究
　　目的：
　　研究(Pulsatilla saponin D,PSD)对小鼠体内发育不同阶段的日本血吸虫的灭杀效果。
　　方法：
　　将感染过日本血吸虫尾蚴的ICR小鼠根据体重随机分为2批进行实验，每批分为6个组，每组10只小鼠。第1批感染血吸虫尾蚴后的14天开始给药，第2批感染尾蚴后的第35天开始给药。在感染后14-18天和35-39天进行尾静脉注射，剂量组（分别为10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg），每天给药2次，连续给药5天；吡喹酮组以300mg/kg剂量口服灌胃（PO）吡喹酮，1次量灌胃；青蒿琥酯组以300mg/kg剂量经口服灌胃（PO）青蒿琥酯，1次量灌胃；以感染后未治疗组作为对照。感染49天后通过摘除眼球进行血液采集，解剖小鼠并收集虫体计算数量，计算减虫率和减雌率，摘取肝脏用4％KOH消化，计算减卵率。
　　结果：
　　PSD组检获平均虫荷数与未经过治疗的对照组相比有显著差异（*P<0.05，**P<0.01），PSD组的减虫率与对照组相比有显著差异（*P<0.05，**P<0.01），PSD组检查获得的平均雌虫数与未经过治疗的对照组相比有显著差异（*P<0.05，**P<0.01），PSD组的减雌率与对照组相比有明显差异（*P<0.05，**P<0.01），PSD组检获平均虫卵数与未经过治疗的对照组相比有显著差异（*P<0.05，**P<0.01）。
　　结论：
　　低剂量组（10mg/kg）、中剂量组（20mg/kg）和高剂量组（40mg/kg）的PSD对于感染后的小鼠均有不同程度的治疗效果：在相同的成长期内，不同剂量的PSD作用于小鼠体内日本血吸虫，高剂量（40mg/kg）组的杀虫效果比其他剂量组效果明显；在同剂量的条件下，PSD对感染35天龄的成虫治疗效果优于14天龄童虫的治疗效果。在所有的不同剂量的实验组中，减雌率高于减虫率，与感染后未治疗的对照组相比，雌虫的数量减少明显。
　　第二部分 PSD抗曼氏血吸虫活性的研究
　　目的：
　　观察PSD对小鼠体内发育不同阶段曼氏血吸虫的杀虫效果。
　　方法：
　　将感染曼氏血吸虫尾蚴的小鼠根据体重随机分2批进行实验，每批4个组，每组10只小鼠。第1批感染后第14天开始给药，第2批感染后第42天开始给药。在感染后第14-18天和第42-46天尾静脉注射40mg/kg PSD，每天2次，连续注射5天；吡喹酮组以300mg/kg剂量经口服灌胃吡喹酮，1次量灌胃；青蒿琥酯组以300mg/kg剂量经口服灌胃青蒿琥酯，1次量灌胃；以感染后未治疗的对照组进行对照。感染第56天后通过摘除眼球取血并解剖小鼠，收集虫体计数，计算减虫率和减雌率。取肝脏用4%KOH消化并计算减卵率。
　　结果：
　　PSD组检获平均虫荷数与未经过治疗的对照组相比有显著差异（*P<0.05，**P<0.01），PSD组的减虫率与未经过治疗的对照组相比有显著差异（*P<0.05，**P<0.01），PSD组检获平均雌虫数与未经过治疗的对照组相比有显著差异（*P<0.05，**P<0.01），PSD组的减雌率与未经过治疗的对照组相比有显著差异（*P<0.05，**P<0.01），PSD组检获平均虫卵数与未经过治疗的对照组相比有显著差异（*P<0.05，**P<0.01）。
　　结论：
　　同一剂量PSD（40mg/kg）对小鼠体内不同发育阶段的曼氏血吸虫有不同程度的治疗效果：42天龄成虫杀灭效果好于14天龄童虫杀灭效果；在所有单一剂量（40mg/kg）的实验治疗组中，减雌率要高于减虫率，与感染后未治疗的对照组相比，雌虫的数量减少明显；PSD可显著降低42天虫龄小鼠体内的总虫荷数量及雌虫的数量。
　　第三部分 PSD对于已经感染日本血吸虫的小鼠体内免疫调控的机制和其杀虫作用的初步研究
　　目的：
　　将肝脏组织进行包埋切片，在光学显微镜下观察PSD对感染了日本血吸虫小鼠肝脏组织病理学的影响，并检测相关体内免疫因子的动态变化，进而研究PSD对小鼠日本血吸虫病引发的炎症反应的影响；通过扫描电子显微镜进行扫描观察血吸虫表皮的形态变化，来初步探索PSD对日本血吸虫的作用机理。
　　方法：
　　将感染日本血吸虫的ICR小鼠根据体重随机分为2批，每批6组，每组10只。第1批感染后第14天开始给药，第2批感染后第35天开始给药。在感染后14-18d组和35-39d尾静脉注射不同剂量的PSD（10mg/kg,20mg/kg和40mg/kg），每天2次，连续5d；吡喹酮组以300mg/kg剂量经口灌服吡喹酮，1次量灌胃；青蒿琥酯组经口服灌胃青蒿琥酯（300mg/kg），1次量灌胃；以感染但是未治疗组作为对照。感染7周后通过摘除小鼠眼球的方式采集血液并解剖小鼠，将肝脏组织包埋切片，在光镜下观察PSD对肝脏肉芽肿的影响；参照产品说明书，用夹心法ELISA测定血清中IgG、TNF-α、IL-4和IL-17。
　　将ICR小鼠感染30条尾蚴，42天之后，用枸橼酸钠（0.3%）溶液灌注冲虫，获得无菌的日本血吸虫成虫。用4ml RPMI1640含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和80μl兔红细胞的培养基对日本血吸虫成虫进行培养，12小时后，将培养基更换含不同浓度的PSD（3.75、7.5、15、30、60μg/ml）培养基中培养72小时。所有的虫体均在37℃，含5% CO2和95%空气的环境中培养7天，培养基每3天更换一次，观察PSD对体外日本血吸虫成虫的杀伤作用。
　　用含有60μg/ml的PSD的培养基培养无菌的日本血吸虫成虫4个小时，然后放置于10%的戊二醛缓冲液中，保持4℃，4小时；PBS溶液(1%)，4℃，2小时。PBS洗完后，将虫体放置在乙醇中脱水，并在液态的 CO2中干燥。最后，将标本用扫描电子显微镜扫描，观察PSD对虫体表皮的影响。
　　结果：
　　感染日本血吸虫但是并未治疗的对照组小鼠肝脏的组织结构明显改变，表现出炎性浸润和产生大量肉芽肿的特点，与未治疗的对照组相比，经PSD治疗后的小鼠肝脏内肉芽肿炎症的大小显著降低。通过 PSD（20mg/kg）对感染14-18天和35-39天的小鼠进行治疗发现，肝脏中炎性细胞的数量显著减少，肝小叶的结构恢复并接近正常组织，大部分肝细胞呈现出正常的状态。
　　通过ELISA的方法对PSD对小鼠免疫反应的影响进行测定，结果表明：与感染组相比，PSD（20mg/kg）能有效降低IgG,TNF-α,IL-4和IL-17的表达，表现出最佳的免疫调节作用。此外，扫描电子显微镜的检查结果显示治疗组雄性虫体表皮呈现异常结构，间结节皮层区呈现广泛的水肿、糜烂和脱皮。
　　结论：
　　20mg/kg和10mg/kg PSD的治疗剂量都可以显著降低肉芽肿的炎性反应，降低血吸虫虫卵对肝的损伤。通过扫描电子显微镜观察，60μg/ml PSD治疗组雄性虫体表面损伤最为严重，受损的皮层脱落，并暴露出皮下组织。这些结果表明，PSD具有一定的抗血吸虫活性的作用。

目录

声明

引言

第一部分 PSD抗日本血吸虫作用的研究

材料与方法

一、实验材料

二、仪器与试剂

三、溶液配置

四、实验方法

结果

一、PSD对日本血吸虫虫荷数的影响

二、PSD对日本血吸虫减虫率的影响

三、PSD对日本血吸虫雌虫数量的影响

四、 PSD对日本血吸虫减雌率的影响

五、 PSD对日本血吸虫虫卵数和减卵率的影响

讨论

第二部分 PSD抗曼氏血吸虫作用的研究

材料与方法

一、实验材料

二、仪器与试剂

三、溶液配置

四、实验方法

结果

一、 PSD对曼氏血吸虫虫荷数的影响

二 、PSD对曼氏血吸虫减虫率的影响

三、PSD对曼氏血吸虫雌虫数量的影响

四、PSD对曼氏血吸虫减雌率的影响

五、PSD对曼氏血吸虫虫卵数和减卵率的影响

讨论

第三部分 PSD对感染日本血吸虫的ICR小鼠免疫调控的作用及其杀虫机制的初步研究

材料与方法

一、实验材料

二、仪器与试剂

三、溶液配置

四、实验方法

结果

一、 PSD对肝脏内肉芽肿的影响

二、PSD对免疫反应的调节作用

三、 PSD对体外培养日本血吸虫成虫的影响

讨论

参考文献

综述：血吸虫病肝纤维化发病机制及相关药物作用靶点的研究进展

本课题所获的基金资助

附录

英文缩略词表

致谢