La/SSB嵌合体自体抗体受体修饰的NK92MI细胞靶向性治疗自身免疫性疾病

摘要

理想上来说，自身免疫性疾病的治疗应该消除致病性的自身免疫细胞而不影响机体正常的保护性免疫功能。但是，可行性的策略一直很难被发现。这里，我们提出在自身抗体介导的自身免疫性疾病中，BCR 识别自身抗原，其可变区发生重排产生只针对自身抗原的特异性序列，此序列只在致病性 B 细胞上表达，而在其它正常的B细胞表面不表达。因此，根据此B细胞受体（BCR）的特异性，构建自身抗原为基础的嵌合体免疫受体的 NK92MI 细胞，杀伤过度反应的表达特异性BCR的B细胞。我们重新编辑了NK92MI细胞，使其表达一个嵌合体自体抗体受体修饰的结构（ CAAR ），此结构包括自身免疫性疾病自身抗原 La/SSB 及CD28-CD137-CD3ζ信号结构域。我们发现La/SSB嵌合体自体抗体修饰的NK92MI （La/SSB-CAAR NK92MI）细胞能够特异性有效的杀伤特异性表达抗La/SSB B细胞受体（La/SSB-BCR）的B细胞来源的细胞（LaA-BCR Romas，LaA-BCRMaver-1）及T细胞来源的细胞（LaA-BCR-Jurkat）。此外，La/SSB嵌合体自体抗体受体修饰的NK92MI细胞（La/SSB-CAAR NK92MI）也能够引起La/SSB自身抗体强阳性的自身免疫性疾病患者血液样本中B细胞的缺失，此现象说明La/SSB嵌合体自体抗体受体修饰的 NK92MI 细胞（ La/SSB-CAAR NK92MI ）能够直接杀伤表达抗La/SSB-BCR过度反应的B细胞（La/SSB-BCR B），并间接杀伤分泌La/SSB自身抗体的浆细胞。在本文中，La/SSB嵌合体自体抗体受体修饰的NK92MI（La/SSB CAAR NK92MI ）细胞通过靶向特异性杀伤表达抗 La/SSB-BCR 的 B 细胞（La/SSB-BCR-B），而不影响机体正常的保护性免疫功能，为探索治疗自身免疫性疾病提供了一个新的策略。 目的：（1）构建特异性表达La/SSB B细胞受体（La/SSB-BCR）的细胞株；（2）构建新型的 La/SSB 嵌合体自体抗体受体修饰的 NK92MI 细胞（La/SSB-CAAR NK92MI）；（3）体外检测La/SSB-CAAR NK92MI对稳定表达LaA-BCR的细胞系的杀伤效应；（4）在La/SSB自体抗体强阳性的病人血液样本中评估它们特异性裂解表达致病性La/SSB-BCR的B细胞的作用。 方法：为了验证La/SSB-CAAR NK92MI对稳定细胞膜表达La/SSB-BCR蛋白的细胞系的毒性作用。首先，我们基因合成了La/SSB序列，连接入pfuse-hIgG1-Fc真核表达载体。载体构建成功后，应用HEK-293T/CHO真核系统内大量表达，并通过Protein G纯化出La/SSB-BCR蛋白。同时，为了诱导可溶性LaA蛋白的表达，我们把编码 LaA 蛋白的 cDNA 亚克隆进入含有 6×HIS 的 pET28a 原核表达载体（LaA-pET28a），LaA-pET28a质粒转化进入E.coli BL21 (DE3)菌株中培养。挑取LaA-pET28a单克隆在3ml含有100μg/mL卡那霉素的LB培养基中37℃培养过夜。然后按照 1:100 的比例稀释在含有 100μg/mL 卡那霉素新鲜的培养基中继续培养，在细菌早期对数期（OD=0.6-0.8）时，加入0.5 mM isopropy-β-D-thiogalactoside（IPTG, Sangon Biotech）37℃诱导 2.5-3h。接着 LaA 蛋白按照试剂说明书经过 Ni-NTA agarose (GE Healthcare Life Sciences)纯化。咪唑应用 PBS 4℃透析过夜去除。Western blotting验证LaA与La/SSB-BCR特异性结合。在此基础上，构建稳定细胞膜表达LaA-BCR的细胞系（Jurkat，Maver-1及Romas）与La/SSB-CAAR NK92MI稳定细胞株。NK92MI与LaA-BCR细胞系按照效靶比为E:T=1:1和2:1的比例共培养，NK92MI选择CD56分子作为标记，Jurkat选择CD3分子作为标记，Maver-1及 Romas 选择 CD19 分子作为标记。通过各自标记分子的百分率来评估基于La/SSB-CAAR NK92MI细胞的体外杀伤细胞的能力。对于自身免疫性疾病标本，我们采用全血B细胞缺失实验进行检测。NK92MI与LaA-CAARNK92MI细胞应用CFSE孵育20min后，与200μl LaA自体抗体强阳性病人的新鲜血液在含有5%的CO2 37℃的培养箱中共培养24小时后，应用CD3、CD45、及CD19抗体孵育30min，BD 红细胞裂解液裂解红细胞。收集 1×104个淋巴细胞（CFSE-/CD45+），数据应用流式分析软件FlowJo进行分析。由于LaA-CAARNK92MI引发的B细胞缺失的百分率我们定义为细胞毒性指数（CTI），应用以下公式计算：LaA-CAAR NK92MI的CTI=[(100/B cell:T cell ratio in sample without LaA-CAARNK92MI细胞) × (B cell:T cell ratio in sample with LaA-CAARNK92MI细胞)]。没有加入NK92MI和LaA-CAARNK92MI样本的B细胞缺失百分率设置为0。 结果：我们成功地纯化出LaA与La/SSB-BCR蛋白，经过Western blotting验证LaA/SSB-BCR蛋白能够与LaA抗原特异性的结合，这为进一步NK92MI杀伤特异性表达 La/SSB-BCR 的细胞系提供了坚实的基础。另外，我们成功构建了稳 定细胞膜表达La/SSB-BCR的细胞株（LaA-BCR Jurkat，LaA-BCR Romas，LaA-BCR Maver-1）及稳定细胞膜表达LaA抗原的嵌合体自体抗体受体修饰的NK92MI细胞（ LaA-CAAR NK92MI ），并验证了 LaA-CAAR NK92MI 能特异性靶向杀伤LaA-BCR Jurkat、LaA-BCR Romas、LaA-BCR Maver-1细胞，随着效靶比的增高，杀伤效果更加显著。另外，在自身免疫性疾病血液标本中， LaA-CAAR NK92MI细胞对La/SSB自身抗体阳性的病人血液中的La/SSB-BCR-B细胞具有特异性的杀伤作用，而对正常的T及B细胞没有杀伤作用。 结论：总的来说，LaA-CAAR NK92MI效应细胞只能够靶向消除具有LaA特异性BCR的致病性B细胞（记忆性B细胞），间接性的抑制了浆细胞分泌LaA自身抗体。当然，自身免疫性疾病的发病机制尚不清楚，机体内自体抗体种类繁多，只凭借一种CAAR NK92MI靶向治疗并彻底治愈自身免疫性疾病的可能性很低，但是，本文探索了一种新的临床应用可行性高的靶向治疗策略，同时为联合各种CAAR 靶向治疗多种抗体引起的自身免疫性疾病提供了重要的研究基础。因此， CAAR NK92MI 细胞治疗是一种创新性的靶向治疗方法，避免了机体免疫被抑制的风险。

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