第一部分：MicroRNA-485-5p在NSCLC中通过紀向调控IGF2BP2抑制细胞增殖和侵袭 研究背景：非小细胞肺癌(Non-small celllung cancer，NSCLC) 约占肺癌总数的80%-85%。远处转移是引起肿瘤患者死亡的最主要原因。上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指细胞失去上皮细胞特征并获得间质细胞表型的一种生物学过程，与上皮癌细胞迁移和侵袭能力变强密切相关。转化生长因子β(Transforming growth factor-β，T G F-β )是一个E M T 的诱导因子。鉴定E M T 的关键性调控基因对于建立有效的抗肿瘤转移的方法具有重要意义。microRNAs(miRs)是一类内源性的、非编码小RNA，可与IB基因3'-非翻译区(3'-untranslatedregions，3’-UTR)结合，导致m R N A降解或翻译抑制。有文献报道，miR-485-5p的表达水平在N S C L C癌患者与健康对照者之间差别很大，具有诊断的价值。然而，miR-485-5p在NSCLC中的预后意义和生物学功能尚不清楚。 研究目的：本部分拟阐明miR-485-5p的表达水平在N S C L C中的临床意义并揭示miR-485-5p在肿瘤生长和转移中的作用和分子机制。 材料和方法：本研究共收集87例NSCLC和癌旁非肿瘤肺组织。所有病例均经病理检查证实。术前无患者接受放疗或化疗。利用Trizol试剂从石蜡包埋的组织样本中提取R N A。利用专门针对miR-485-5p的茎环引物进行反转录，利用TaqMan microRNA Assay kit分析试剂盒进行实时定量P C R检测miR-485-5p的表达水平。采用逆转录PCR 法扩增M D M 4、NUCB1、DEFA、IGF2BP2和MMP14 3‘-UTR片段，并将其克隆到p M I R报告萤火虫荧光素酶载体中。通过P C R扩增全长IGF2BP2和miR-485-5p前体的基因片段，并将其克隆到pcDNA3.1(+)载体中。 利用脂质体转染试剂将特定质粒转染至NSCLC细胞，应用800μg/mL的G418筛选2周获得稳定转染细胞株。接种细胞至9 6孔板，在含10%胎牛血清的完全培养基下培养1~5天，应用噻唑蓝（M T T )法检测细胞增殖情况。应用Transwell侵袭试验检测细胞侵袭能力。应用70%乙醇固定细胞，用50μ g/mL碘化丙啶染色液孵育细胞，应用流式细胞仪分析细胞周期分布。 细胞与5 n g/m L的TGF-β孵育4 8小时，在相差显微镜下观察细胞形态，应用蛋白免疫印迹法检测E-cadherin和 vimentin的表达情况。应用脂质体3000把3’-U T R报告质粒与miR-485-5pmimic或对照寡核苷酸共转染H E K 2 9 3 T细胞。转染编码海肾荧光素酶的PRL-TK载体用于监测细胞转染效率.。转染48小时后用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。将稳定表达miR-485-5p或对照m i R的A549细胞植入雄性BALB/c裸鼠皮下(2X106个细胞/鼠，n= 5)。每周测量肿瘤体积，监测肿瘤生长情况。细胞植入后4周处死小鼠，切除移植瘤并称重。用蛋白免疫印迹法检测肿瘤组织中IGF2BP2蛋白的表达。将稳定表达miR-485-5p或对照m i R的A549细胞(2X106细胞/小鼠，n=4)经尾静脉注入裸鼠体内。7周后处死动物，取肺组织进行病理检查。测定肺内微小转移结节的数目。平均数据采用Student’st-test检验或单因素方差分析，后用post hoc Tukey's检验。采用Mann-WhitneyU检验比较癌组织与非癌组织miR-485-5p的平均水平。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank检验法测定差异。P<0.05。 结果：N S C L C组织中m i R-4 8 5-5 p表达水平明显低于癌旁肺组织。miR-485-5p低表达与晚期肿瘤分期(P = 0.0216)和淋巴结转移(P = 0.0037)具有显著相关。miR-485-5p低表达组总生存率(P= 0.0136)和无病生存率(P= 0.0085)明显低于高表达miR-485-5p组。在体外过表达miR-485-5p抑制N S C L C细胞（N S C L C ) 生长和侵袭并逆转上皮间充质转化。与正常人支气管上皮BEAS-2B细胞相比，N S C L C细胞(A549、NCI-H460 和 NCI-H1299)的 miR-485-5p 表达显著降低(P < 0.05)。过表达miR-485-5p可显著降低A 5 4 9和NCI-H1299细胞的增殖能力和侵袭能力(P < 0.05)?培养72h后，miR-485-5p能够显著抑制A549和NCI-H1299细胞的增殖，分别抑制74%和56%。miR-485-5p过表达促进A549细胞G0/G1期阻滞，阻断TGF-p诱导的上皮间充质转化。相反，抑制miR-485-5p则可促进细胞增殖和侵袭能力。miR-485-5p过表达显著降低IGF2BP2 3 ’-U T R诱导的荧光素酶报告活性（P<0.05)，而对M D M 4、NUCB1、D E F A和 M M P 1 4的 3’-UTRs报告基因的活性没有显著影响。过表达miR-485-5p导致A549和NCI-H1299细胞中内源性IGF2BP2的表达明显下调。A549细胞过表达I G F 2 B P 2能够逆转miR-485-5p介导的生长抑制和侵袭作用。沉默IGF2BP2引起A 5 4 9细胞增殖和侵袭能力下降。体内实验表明，过表达miR-485-5p能够明显抑制A 5 4 9移植瘤的生长，最终肿瘤重量为对照组的3 0% (P <0.05) 。miR-485-5p高表达组I G F 2 B P 2表达水平明显降低（P<0 . 0 5 )。并且，miR-485-5p过表达显著降低肺转移的能力（P<0.05) 。 结论：miR-485-5p下调预测N S C L C预后不良，其过表达通过抑制IGF2BP2阻断NSCLC细胞的生长和侵袭。 第二部分：MicroRNA-381通过NF-k B信号通路抑制NSCLC生长并增加顺销敏感性 研究背景：尽管在过去几十年里治疗方面有所改善，非小细胞肺癌（NSCLC)的5年总生存率仍很低。由于出现耐药性，化疗的疗效受到很大的限制。microRNA (miRs)作为内源性非编码小R N A 参与调节N S C L C细胞对顺铂的化疗敏感性。miR-381在人肺腺癌中表达下调，而 miR-381过表达通过抑制分化抑制因子1(ID1)显著减少细胞的迁移和侵袭。然而，miR-381在N S C L C细胞生长和存活中的作用尚不清楚。 研究目的：本研究旨在确定miR-381对N S C L C细胞增殖和凋亡的调控作用，并探讨其对顺铂敏感性的影响和分子机制。 材料和方法:耐顺铂的A 5 4 9细胞(A549/CDDP)是通过暴露在浓度逐步增加(0.5， 1，2，4和10 μ M ) 的顺铂中获得。A549细胞暴露于0.5μM顺铂3天恢复4天。这种治疗在每种顺铂浓度下重复一次。然后将细胞随着顺铂达10μM 。顺铂耐药细胞保持在添加4m M 浓度的顺铀的培养基中进行培养。利用脂质体将miR-381前体表达质粒和阴性对照质粒转染至A 5 4 9和NCI-H460细胞中，然后加入G418 (800微克/毫升)筛选2周获得稳定转染细胞株。细胞接种于密度为5 X 103细胞/每孔的9 6孔板中。在培养24?7 2小时后，收集细胞，通过M T T法测定细胞活性。对顺铂的毒性实验，转染不同质粒的A549/CDDP细胞分别暴露于不同浓度的顺钴0?40μM ，48小时后，采用M T T法检测细胞活力，测算顺铂半数抑制浓度（IC50)。细胞接种于6孔板，细胞的浓度为600细胞/孔，孵育2周后，用结晶紫染色，计数由>5 0个细胞组成的菌落数。细胞用7 0%乙醇固定，应用50μ g/ml碘化丙啶染色，使用流式细胞仪进行进行细胞周期分析。转染48小时后收集细胞，并用70%乙醇固定细胞，并用异硫氰酸荧光素标记的Annexin-V和PI共同染色标记。应用流式细胞术分析细胞凋亡情况。利用荧光素酶报告基因测定依赖N F-k B 的转录活性。共转染N F -K B-luc报告质粒、pRL-CMV表达质粒和miR-381或对照miRNA。48小时后，用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶的活性。采用Trizol试剂提取总细胞RNA， 进行反转录，然后采用TaqMan m i R N A检测系统对miR-381进行实时P C R分析。细胞裂解，裂解缓冲液含有蛋白酶抑制剂，通过离心分离沉淀。上清液作为细胞质提取物收集。该沉淀悬浮在核提取液，并在冰上放置3 0分钟和13000 g离心1 5分钟，上清液作为核提取物。蛋白提取物行免疫印迹实验检测目的蛋白的表达情况。稳定表达miR-381或对照m i R的A549细胞( 2 X 106个细胞/只)皮下注射雄性BALB/c裸鼠(每组5只裸鼠）。每周测量肿瘤体积，共测量4周，并绘制肿瘤生长曲线。每个样品三个复孔，重复至少三次。所有数据均为平均数土标准差和Student’s t检验和单因素方差分析和Tukey多重比较检验分析。P<0.05被认为具有统计学意义。 结果：M T T法显示，与转染对照的m i R-N C的细胞相比，转染miR-381前体能够显著(P< 0.05)抑制A 5 4 9和NCI-H460细胞的增殖。过表达miR-381导致集落形成能力下降约8 0%。体内致瘤实验进一步证实miR-381过表达延迟了A 5 4 9异种移植肿瘤的体内生长。与转染对照的miR-的N S C L C细胞相比，过表达miR-381导致细胞在G 0/G 1期的百分比显著增加，并且在S期的细胞百分比显著降低(P<0.05)。蛋白印迹分析证实过表达miR-381的A549和NCI-H460细胞中p21和p27的蛋白水平的水平显著高于(P<0.05)转染对照m i R的对应细胞中的水平，而细胞周期蛋白D 1和CDK4的水平则显著低于(P<0.05)转染对照m i R的对应细胞中的水平。与A549亲代细胞相比，顺铂抗性的对应物(A549/CDDP)中miR-381的水平显著减低，miR-381在顺铂抗性的对应物(A549/CDDP)中的水平较对照组m i R中低大约2.8倍(P < 0.05)。过表达miR-381使A549/CDDP细胞对顺铂更敏感，IC50值降低了 6倍。过表达miR-381显著诱导A 5 4 9/C D D P细胞发生凋亡，使凋亡率从对照组的7.4±1.4%增加到28.2±2.1%(P<0.05)。恢复miR-381的表达降低了NF-k B p 6 5在细胞核内的积累,增加了亲代和顺铂耐药的A549细胞中IK B a 的水平。与转染对照m i R的细胞相比，过表达miR-381导致依赖NF-k B p 6 5的转录活性显著下降，并降低了Bcl-2和Bcl-XL的表达(P< 0.05)。I D 1的过表达恢复了NF-k B p 6 5的核转位，并增加了miR-381过表达的A 5 4 9细胞中Bcl-2和 B c l-X L的表达水平。过表达ID1(P < 0.05)恢复了过表达miR-381的A549细胞的生长。在A549/CDDP细胞中，ID1的共表达几乎完全阻止了过表达miR-381诱导的A 5 4 9细胞对顺销的IC50值的降低。此外，通过过量表达ID1显著地消除了miR-381介导的凋亡。 结论：miR-381过表达抑制NSCLC细胞增殖和肿瘤发生，并增加NSCLC细胞对顺铂的敏感性。通过下调I D
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