葛根总黄酮、葛根素、大豆甙元诱导K-562细胞凋亡分子机制的初步研究

摘要

慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia/chronic granulocyticleukemia；CML/CGL)简称慢粒，是一种获得性多能造血干细胞的克隆增殖性疾病，Ph染色体t(9；22)(q34；q11)为其特征性遗传学标志。这一特异的染色体异常产生的BCR/ABL融合基因，转录翻译生成分子量为210kDa的蛋白—P210BCR/ABL。该蛋白具有很强的酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)活性，是CML形成的分子基础。Bel-2基因、死亡受体及其配体Fas/FasL都是与细胞凋亡密切相关的重要信号分子。
　　 血复康是江苏省中医院血液科于1989年根据中医解毒活血法独创的复方制剂，主要由青黛、莪术、葛根组成。近五年课题组对血复康治疗慢粒在细胞和分子水平的作用机制方面进行了较为深入的研究，证明了不同浓度、不同时段血复康处理K-562细胞(CML细胞株)后，BCR/ABL融合基因、JWA基因及抗凋亡基因Bcl-2均呈浓度及时间依赖性下降；细胞形态学出现典型的凋亡特征；对血复康各组分(青黛、葛根、莪术)诱导K-562细胞凋亡的初步研究表明：三种单药成分均能诱导K-562细胞凋亡，而且其诱导细胞凋亡的途径不尽相同。令人感兴趣的是，不同浓度葛根总黄酮(0、2.5、5.0、7.5、10、20 mg/ml)处理K-562细胞24小时后，细胞凋亡率和BCR/ABL融合蛋白均呈浓度依赖性下调；部分上调K-562细胞P53蛋白的表达，触发了我们进一步研究其可能分子机制的兴趣。本课题试图进一步从mRNA和蛋白水平研究葛根总黄酮及其成分葛根素、大豆甙元诱导K-562细胞凋亡可能的分子机制。
　　 实验目的：1.研究不同浓度葛根总黄酮(0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/ml)、葛根素(0、0.1、1.0、5.0、10 mmol/L)、大豆甙元(0、0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L)处理K-562细胞后不同时段(0、24、48、72小时)对细胞增殖和凋亡的影响；2.经上述药物处理K-562细胞后，各组BCR/ABL融合基因、Bcl-2基因在mRNA水平表达的变化；3.各组药物处理前后P210BCR/ABL、Bel-2、Fas/FasL在蛋白水平表达的变化。分别探讨不同浓度、不同时段葛根总黄酮及其成分葛根素、大豆甙元对细胞增殖、凋亡及相关细胞凋亡基因表达的影响及可能的分子机制。
　　 实验方法：以K-562细胞株为研究对象，采用CCK-8法检测不同浓度、不同时段葛根总黄酮及其成分葛根素、大豆甙元对K-562细胞增殖的影响；Hoechst33258染色及流式细胞仪检测细胞凋亡；半定量逆转录聚合酶链反应(semi-quantitatiVe reverse transcription polymerase chain reaction，SQ-RT-PCR)检测各组药物作用K-562细胞前后BCR/ABL融合基因、Bcl-2基因表达的变化；Western blot检测P210、Bcl-2、Fas/FasL蛋白的变化。
　　 实验结果：1.葛根总黄酮及其成分葛根素、大豆甙元对K-562细胞增殖的影响：不同浓度、不同时段葛根总黄酮、葛根素、大豆甙元与细胞增殖抑制成正相关。2.葛根总黄酮及其成分葛根素、大豆甙元对K-562细胞凋亡的影响：①Hoechst染色结果：低浓度葛根总黄酮(1 mg/ml)、葛根素(1 mmol/L)、大豆甙元(0.5 mmol/L)处理K-562细胞48小时后，可检测到明显的细胞凋亡；②流式细胞仪检测结果：不同浓度葛根总黄酮及其成分葛根素、大豆甙元处理K-562细胞48小时后，细胞凋亡率呈浓度-时间正相关。3.半定量RT-PCR结果：不同浓度葛根总黄酮、葛根素处理组BCR/ABL融合基因的表达呈浓度依赖性下降；而大豆甙元处理组无明显变化；Bcl-2基因的表达在各处理组均无统计学意义。4.western blot结果：葛根总黄酮、葛根素处理组P210蛋白的表达呈浓度.时间依赖性下降；而大豆甙元处理组无明显变化；Bcl-2基因和蛋白的表达在各处理组均无统计学意义；葛根总黄酮处理组Fas、FasL蛋白的表达呈浓度.时间依赖性上升，而葛根素、大豆甙元处理组无统计学意义。
　　 结论：1.葛根总黄酮及其成分葛根素、大豆甙元均能抑制K-562细胞增殖、诱导细胞凋亡，并呈时间及浓度依赖性上调。2.不同浓度、不同时段葛根总黄酮、葛根素处理组在mRNA和蛋白水平均能部分抑制K-562细胞BCR/ABL的表达，说明其诱导K-562细胞凋亡的作用可能是通过部分降低酪氨酸激酶活性而实现的；而大豆甙元处理组并未显示相应的变化趋势。3.葛根总黄酮处理组Fas、FasL蛋白表达与浓度和时间呈正相关。4.不同浓度、不同时段葛根总黄酮及其成分葛根素、大豆甙元处理K-562细胞前后抗凋亡基因Bcl-2在mRNA和蛋白水平均无明显变化。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

第一部分理论研究

一、慢性粒细胞白血病的流行病学

二、慢性粒细胞白血病的病因、病机

三、慢性粒细胞白血病细胞株K-562

四、血复康研究成果

五、中药葛根提取物现代药理学研究

第二部分实验研究

一、实验目的

二、实验材料

三、细胞模型的建立

四、实验方法

五、实验结果

六、结论

七、讨论

八、小结

参考文献

致谢

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