黄葵素对DN大鼠模型及肾系膜细胞NF-κB信号通路干预作用的研究

摘要

目的:1.从分子、细胞及动物模型水平多层次探讨糖尿病肾病背景下肾脏局部NF-κB通路激活，及其对糖尿病肾病的影响。2.评估黄葵素降低蛋白尿的作用，明确其对NF-κB通路与下游炎症因子的影响。
　　材料和方法:1.动物实验:雄性SD大鼠随机分为正常对照组、糖肾对照组、阳性药对照组(厄贝沙坦12mg/Kg)以及不同剂量黄葵素治疗组(75mg/Kg/d、135mg/Kg/d、300mg/Kg/d)，正常对照组10只，其余各组40只。选择高糖高脂饮食结合低剂量链脲菌素(STZ)诱导SD大鼠制备DM模型，该模型早期表现为高血糖，后期出现蛋白尿等DN表现，体现了DM进行性肾损害的特点。DN成模后，所有药物均灌胃给药，正常对照组、糖肾对照组每日接受等量生理盐水灌胃。连续给药8周后收集标本，ELISA法检测大鼠血清及肾组织TNF-α、 IL-1β和IL-6表达水平;免疫组化检测肾组织NF-κB的表达水平;Western-blot检测肾组织细胞核的NF-κB p65蛋白表达水平;Q-PCR检测肾组织NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表达。
　　2.体外实验:将大鼠肾小球系膜细胞(GMC)分为空白血清组、TNF-α组、药物血清加TNF-α组。体外培养24小时，加入血清36h后，加入浓度为10ng/ml的TNF-α诱导损伤12h，双荧光素酶报告基因检测大鼠肾系膜细胞中NF-κB p65转录水平;ELISA法验证上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平。
　　结果:1.药物干预各组均能延缓大鼠体重下降，与糖肾组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。黄葵素高剂量组及厄贝沙坦组可显著改善DN大鼠的血糖，降低尿ACR，与糖肾组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。2.ELISA结果示，与糖肾组相比，黄葵素中剂量组可显著降低DN大鼠血清中TNF-α水平，肾组织中IL-6的分泌水平(P＜0.05);黄葵素高剂量组可抑制DN大鼠血清和肾组织中TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌水平，差异具有统计学意义(P＜0.05);厄贝沙坦组可显著降低血清及肾组织中IL-6、IL-1β的分泌水平，血清中TNF-α的水平也得到抑制，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。3.Q-PCR结果示，与糖肾模型组比较，药物干预各组肾组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平均有所下降，黄葵素高剂量组、厄贝沙坦组差异具有统计学意义(P＜0.05)。4.免疫组化结果示，药物干预各组肾组织细胞核中NF-κB p65表达水平均有下降，其中黄葵素高剂量组及厄贝沙坦组与糖肾组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。5.WesternBlot结果示药物干预后各组肾组织细胞核中NF-κB p65蛋白的表达水平均有下降，但总mRNA表达水平与与糖肾组比较，无明显差异(P＞0.05)。6.大鼠肾系膜细胞胞内luciferase assay实验结果显示，TNF-α能够诱导胞内NF-κB信号活性上调，而经过含有黄葵素血清处理的细胞内，此上调趋势受到显著抑制，经含药血清处理的GMC细胞上清液中，TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌均显著性下调，与TNF-α组相比，差异有统计学意义(p＜0.05)。
　　结论:1.糖尿病背景下肾脏局部NF-κB通路激活，诱发炎症反应释放炎症因子，导致蛋白尿的发生及发展。2.黄葵素可显著缓解糖尿病肾病尿蛋白，其肾保护机制可能与抑制NF-κB p65炎性反应信号通路，降低促炎因子释放有关。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 理论研究

1．现代医学DN研究进展

1．1 发病机制

1．2 现代医学治疗进展简述

2．中医浅析糖尿病肾病

2．1 病名溯源

2．2 病因病机

2．3 糖尿病肾病中医治疗进展

第二部分 实验部分

1．实验材料

1．1 实验动物

1．2 实验药物

1．3 主要实验试剂及耗材

1．4 实验仪器

1．5 主要实验溶液

2．实验方法

2．1 体内实验

2．2 体外实验部分

2．3 数据统计分析

3 结果

3．1 黄葵素能缓解DN大鼠的一般症状

3．2 黄葵素能抑制大鼠血清及肾组织炎症因子的分泌

3．3 黄葵素抑制大鼠肾组织中NF-κB信号通路

3．4 黄葵素能抑制GMC中NF-κB信号通路活性

4 讨论

结语

1、本次研究的主要成果

2、本次研究存在的不足和展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢