基于水杨酸蓄积的实验小鼠糖尿病状态下阿司匹林抵抗机制及川芎嗪干预研究

摘要

阿司匹林作为临床常用的抗血小板药物，在心脑血管的二级预防中发挥着重要作用。临床上口服阿司匹林的部分患者仍然会发生血栓栓塞性事件，即存在“阿司匹林抵抗”(aspirin resistance，AR)现象。糖尿病已经被证实是AR的危险因素，但目前糖尿病相关的AR机制仍然不清楚。活血化瘀类中药已被广泛应用于临床抗血小板和抗凝治疗，其活性成分已成为AR治疗的替代药物之一。
　　目的:
　　1.评估糖尿病状态下阿司匹林的抗血小板作用在性别上的差异;
　　2.揭示阿司匹林的主要代谢物SA与糖尿病状态下AR具有潜在的联系及可能的机制;
　　3.从内源性物质代谢变化角度探讨了川芎嗪(TMP)干预糖尿病状态下AR的代谢调控机制;
　　方法:
　　高脂饲料(HFD)结合链脲佐菌素(STZ)诱导2型糖尿病(T2DM)病小鼠模型。正常饲料喂养小鼠随机分为2组，每组14只（雌雄各7只），分别设正常组(Control)，正常+阿司匹林组(Control+Asp); HFD/STZ诱导T2DM小鼠随机分为5组分别为2型糖尿病模型组(T2DM)、2型糖尿病模型+阿司匹林组(T2DM+Asp)（雌雄各7只）;2型糖尿病+Asp组预给水杨酸(T2DM+SA+Asp)、2型糖尿病+Asp组预给碳酸氢钠(T2DM+ NaHCO3+Asp)，T2DM+Asp组预先给予川芎嗪注射液(T2DM+ TMP+Asp);（雌鼠7只）;，Asp剂量13 mg/kg/day; SA剂量10 mg/kg/day; NaHCO3剂量为600mg/kg/day; TMP剂量为100 mg/kg/day; SA和NaHCO3给药方式为灌胃;TMP给药方式为腹腔注射，均在阿司匹林给药前，给药周期同为10天。
　　小鼠血糖用一次性血糖仪检测;血清胰岛素、胆固醇、甘油三酯用酶法检测;肾组织病理切片通过光学显微镜观察;Elisa法检测小鼠血清T IL-1β、 IL-6水平;采用流式细胞技术检测血小板CD62P(p-selectin)表达;放免法检测小鼠血浆TXB>6-keto-PGF1α水平;HPLC检测小鼠血浆SA水平;qPCR法测定小鼠主动脉COX-2及肾脏转运体(OATs、SMCTs、URAT1)mRNA水平;气相色谱/质谱(GC/MS)联合多元统计分析用来确定TMP干预糖尿病状态下AR小鼠血浆内源性代谢物的变化。
　　结果:
　　1.T2DM雌性小鼠中出现明显AR
　　HFD/STZ诱导的T2DM小鼠出现体重增加，高血糖和高脂血症，虽然血浆胰岛素水平轻度升高，提示有胰岛素抵抗。T2DM雌性小鼠血小板表面CD62P表达高于正常雌性小鼠，提示糖尿病状态下可以增加雌性小鼠的血小板活性;正常组小鼠给予阿司匹林后，无论雌性还是雄性血小板表面CD62P表达均显著下调而T2DM雌性小鼠给予阿司匹林后血小板表面CD62P表达与模型组比较无明显改变，提示T2DM雌性小鼠给药后血小板活性任然较高，出现了AR。T2DM雌性小鼠长期给予阿司匹林后TXB2/6-keto-PGF1α的比值不仅没有降低，反而有增高的趋势，这也和之前血小板表面CD62P表达结果相一致。T2DM雌性小鼠给予阿司匹林后血小板表面CD62P表达及TXB2/6-keto-PGF1α水平均降低。
　　2.糖尿病状态下肾脏相关转运体下调导致SA的蓄积，SA抑制血管内皮细胞代偿性上调COX-2表达和活性
　　长期给予阿司匹林后，T2DM雌性组随着阿司匹林给药时间的增加，SA第1、5、10天谷浓度明显增加，且在第10天SA各时间点的血药浓度明显升高，T2DM小鼠长期给予阿司匹林后出现了SA蓄积，而T2DM雄性小鼠没有出现SA蓄积现象。在预先给予SA的T2DM雌性小鼠较模型组出现了SA浓度及血小板表面CD62P表达、TXB2/6-keto-PGF1α水平升高，然而给予NaHCO3后逆转了这一结果。且根据相关性分析发现SA浓度和血浆TXB2/6-keto-PGF1α水平有相关性。我们进一步研究发现SA高浓度的T2DM雌性小鼠腹主动脉COX-2的mRNA和蛋白水平水平都显著下调，且伴随着 COX-2下游产物前列环素(PGI2)的稳定代谢物6-keto-PGF1α的降低，从而间接导致血浆中TXB2/6-keto-PGF1α水平升高，因此增加了T2DM雌性小鼠的血小板活性。我们发现T2DM雌性小鼠肾脏相关SA排泄依赖转运体如OAT1、OAT3、SMCT1、URAT1mRNA水平较正常组下调明显，且出现肾小管空泡病变，该结果表面SA蓄积和肾脏转运体下调相关。
　　3.TMP对糖尿病状态下AR的干预伴随对相关代谢通路的调节
　　运用代谢组学GC/MS研究手段，结合之前的实验结果，我们从小鼠血浆中测定分析得出120个化合物，经过数据库鉴定得到79种代谢物。在PLS-DA的score-plot上可以发现，对照组和糖尿病模型组可以较好地区分，同时对照组和对照给药组间的趋离程度明显大于模型组和模型给药组;与T2DM雌性小鼠中AR相关指标较为一致。我们进一步发现模型状态下显著升高的代谢物质有丙酮酸、三羟基丁酸、4-羟丁酸、花生四烯酸、葡萄糖、松二糖、胆固醇等，下降的物质有乳酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸。然而，TMP联合阿司匹林可以逆转上述部分异常代谢物水平，如花生四烯酸、葡萄糖、丙酮酸、胆固醇、尿酸和尿素，提示TMP可能通过改变花生四烯酸代谢，丙酮酸代谢，糖酵解，柠檬酸循环，色氨酸代谢通路从而干预糖尿病状态下的AR。
　　结论:
　　本研究揭示了长期给予T2DM雌性小鼠阿司匹林后出现SA蓄积和AR。其可能机制是SA抑制了病理状态下血管内皮细胞COX-2表达和活性的代偿性上调，打破了机体原有的COX-1/COX-2功能平衡，从而减少保护性PGI2的生成。通过代谢组学分析发现TMP通过改变多条代谢通路从而干预糖尿病状态下的AR。研究结果提示干预SA代谢障碍可能为AR提供了一个新的治疗策略;临床联合应用TMP可能通过纠正机体的代谢紊乱而发挥改善糖尿病状态下AR的效应。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一部分 文献研究

第一章 阿司匹林抵抗机制研究进展

1 药代动力学机制

2．药效学抵抗机制

3．生理因素

4．病理因素

5．总结与展望

第二章 代谢组学的应用

第一节 代谢组学在个体化治疗上的应用

第二节 代谢组学在阿司匹林抵抗机制上的应用

第三节 代谢组学在糖尿病研究中的应用

第四节 代谢组学在中医药现代化的应用

第三章 活血化瘀类中药干预阿司匹林抵抗的研究进展

第一节 活血化瘀药干预阿司匹林抵抗I临床研究

第二节 活血化瘀药干预阿司匹林抵抗机制研究

第三节 活血化瘀药干预阿司匹林抵抗的优势

第二部分 实验研究

第一章 阿司匹林对T2DM小鼠药效作用的研究

前言

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

第二章 水杨酸蓄积诱导的T2DM小鼠AR机制研究

前言

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

第三章 T2DM雌性小鼠AR及川芎嗪干预代谢组学研究

前言

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

参考文献

全文总结与展望

致谢

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