溃疡病与烂皮病胁迫下北京杨水分生理变化及miRNA的差异表达

摘要

溃疡病和烂皮病是对杨树危害最为严重的病害，与杨树的水分生理状况紧密相关。虽然利用药剂和生物防治方法已取得了很大成效，但从另外的角度讲，培育抗病品种才是最为有效的手段。鉴于常规育种定向培育抗病林木品种的困难，如果弄清溃疡病和烂皮病侵入杨树的分子机理，则可用分子生物学和基因工程手段定向培育抗病品种。MicroRNA是动植物体内广泛存在的一类非编码RNA，广泛参与生命的各个进程。从miRNA差异表达调控角度出发，对杨树溃疡病和烂皮病发生抗病防御机制进行分析，可为杨树抗病育种提供理论依据，并为其他相关植物病害的病理机制研究提供全新的视角，因此具有重要的理论和借鉴意义。
　　本研究以最易染病的北京杨为试验材料，通过高通量测序，对溃疡病和烂皮病胁迫下北京杨miRNA的差异表达状况结合杨树分别感染两种病后的水分生理变化进行研究，以期为抗病育种提供更多参考。取得的结果如下:
　　1、在试验处理后的第4天溃疡病处理组、烂皮病处理组与对照组比较，水导损失率都显著高于对照组，第6、8天的两组与对照组间的水导损失率差异并不显著。两种病菌处理下的植株的水导损失率的变化规律一致。因此，两种病菌处理的试验结果表明，两种病菌接种初期显著降低了杨树的水分疏导能力，而随着试验处理时间的延长，北京杨水分运输能力逐渐恢复。
　　2、溃疡病菌、烂皮病菌胁迫下，植株项端水势在处理的后第6、8天，溃疡病和烂皮病两组处理组分别显著低于对照组。处理后第4天的溃疡病和烂皮病两组与对照组的顶端水势差异不显著。且顶端水势在处理后呈逐渐降低的趋势。北京杨接种上部的枝条的水导损失率在病原菌处理初期显著降低了植株的水分疏导能力，随着处理时间的延长，水分输导能力被逐渐恢复。
　　顶端水势的变化规律与木质部水导损失率的变化是协调同步的。随着水势的降低，水导损失率升高。这些都进一步证明了溃疡病和烂皮病是水分相关病害。
　　3、溃疡病、烂皮病菌处理植株和对照组植株的接种上部和下部的枝条韧皮部、木质部的可溶性糖和淀粉含量。结果发现，试验处理后第4、6、8天，病原菌处理的两组都使得杨树枝干韧皮部可溶性糖含量增加。而病原菌处理对杨树枝干木质部可溶性糖含量影响并不显著。接种上部的韧皮部、木质部的可溶性糖含量都要高于下部，可知可溶性糖在韧皮部及木质部中呈垂直分布。试验处理后第4、6、8天，病原菌处理的两组和对照组的枝条韧皮部和木质部的淀粉含量没有明显的规律性变化，病原菌处理对枝条淀粉含量的影响不显著。
　　4、利用Illumina高通量测序技术，对溃疡病、烂皮病胁迫下样本的小RNA进行测序，检测出了54，090，831 clean reads的已知miRNA和30，155，744 clean reads的新miRNA。对差异表达显著基因进行靶基因预测，这些预测的靶基因具有多种功能，其中miRNA482c-3p和novel-401、novel-439预测的靶基因是病程蛋白， miRNA172、miRNA169、miRNA166、miRNA160等多个家族基因的靶基因与抗性胁迫相关。而大多数的与植物自身的生理代谢有关。
　　对差异表达基因的靶基因进行GO功能分析，许多靶基因涉及转录、新陈代谢以及胁迫相关的蛋白质，当遭遇病害胁迫时，这些蛋白在基因网络调控中可能起到重要的作用。KEGG的Pathway富集分析，对这些显著差异表达的基因进行分析发现了2个是与植物抗病性相关的通路，对我们后续的研究具有很大的价值。对进一步揭示杨树溃疡病、烂皮病的病理学机制和水分生理学研究具有重要的意义。

目录

声骧

摘要

第一章 绪论

1 研究背景

2 杨树溃疡病的研究进展

2．1 杨树溃疡病的症状

2．2 杨树溃疡病的病原菌

2．3 杨树溃疡病的发生

2．4 杨树溃疡病的致病机理

2．5 杨树对溃疡病的抗病机制

3 杨树烂皮病的研究进展

3．1 杨树烂皮病的症状

3．2 杨树烂皮病的病原菌

3．3 杨树烂皮病的发生

4 miRNA的研究进展

4．1 miRNA的特点

4．2 miRMA的合成

4．3 mi RNA的作用机制

4．4 miRNA的研究方法

4．5 miRNA的起源与进化

4．6 miRNA在植物的作用

5 本研究的构想及出发点

6 拟采用的技术路线

第二章 溃疡病与烂皮病胁迫下北京杨的水分生理变化

1 材料与方法

1．1 病原菌来源

1．2 菌株的活化与培养

1．3 植物材料及培养

1．4 试验的分组与接种

1．5 溃疡病菌、烂皮病菌侵染的北京杨枝干水力学特征实验的取样方法

1．6 溃疡病菌、烂皮病菌侵染过程中北京杨枝条顶端水势的测定

1．7 溃疡病菌、烂皮病菌侵染过程中北京杨枝干水导损失率的测定

1．8 溃疡病菌、烂皮病菌侵染过程中北京杨枝干可溶性糖含量和淀粉含量的测定

2 结果与分析

2．1 北京杨在溃疡病与烂皮病菌胁迫下植株地上部分的水力学特征变化

2．2 溃疡病菌和烂皮病菌侵染对北京杨枝干可溶性糖和淀粉含量的影响

3 讨论

3．1 植株水势的变化

3．2 栓塞

第三章 溃疡病菌与烂皮病菌胁迫下miRNA高通量测序分析

1 材料与方法

1．1 取样

1．2 总RNA的提取

1．3 miRNA测序

1．4 miRNA测序数据分析流程

1．5 qRT-PCR验证miRNA的差异表达

2 结果与分析

2．1 总RNA质量检测

2．2 原始数据质量信息统计

2．3 测序数据过滤

2．4 小RNA序列的长度分布分析

2．5 Clean Reads与参考序列比对分析

2．6 已知miRNA分析

2．7 新miRNA预测

2．8 miRNA差异表达分析

2．9 miRNA聚类分析

2．10 miRNA靶基因预测

2．11 靶基因GO功能注释

2．12 靶基因KEGG功能注释

2．13 qRT PCR对差异表达miRNA的验证

3 讨论

3．1 miRNA165和miRNA166的潜在作用

3．2 miRNAl69的潜在作用

3．3 miRNAl72潜在作用

第四章结论

参考文献

致谢

附录