HLA区生精相关基因SNP与特发性男性不育的相关性研究

摘要

人类精子发生是极其复杂的过程，涉及细胞增殖、减数分裂、细胞分化等一系列细胞活动。据估计，至少有2000多个基因参与精子发生过程，其中某些基因可能为男性不育的致病或易感基因。利用单核苷酸多态性(single nueleofidepolymorphism，SNP)技术对这些基因的筛选和鉴定不仅有利于揭示特发性男性不育的发病机理，为治疗提供一定的启示，而且能够为辅助生殖提供遗传筛选，利于人口出生质量的提高。 动物实验表明，MHC区参与精子发生过程。数字化差异显示技术发现，人的第6号染色体短臂MHC区存在男性不育的候选基因。现已证明，HLAⅠ类基因HLA-A33,-B13和-B44和HLAⅡ类基因HLA-DR和HLA-DRB1都与非阻塞无精症显著相关。但是，HLA Ⅰ和HLAⅡ类抗原在精子表达却很低，并且在正常对照和不育患者的精液里HLAⅠ和HLAⅡ类抗原的表达没有差异。连锁不平衡假说的兴起提示了我们：HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ类基因尽管与男性不育表现出很强的关联性，但并非是引起疾病的直接原因，而只是一种可供检出的遗传标志，真正疾病易感基因可能是HLA区的非HLA基因或HLAⅢ区的基因，只是这些基因通过与HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ的连锁而被藏匿了起来。鉴于此，我们对HLAⅠ和HLAⅡ区附近的非HLA基因和HLAm区的基因进行了搜索和筛选，最后锁定生精相关基因RXRB(视黄醇B受体)和HSP70基因(HSP70-1、HSP70-2和HSP70-hom)。本文就这四个基因常见SNP位点与特发性男性不育展开关联性研究，结果如下： 第一部分 RXRB基因多态性和特发性男性不育的关系 经过严格筛选，我们排除了临床病因已知的患者血样，共收集特发性男性不育患者血样367份和正常已育男性血样355份，运用聚合酶链式反应一限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法研究了RXRB基因+378(T/A)，+140(A/T)，+7(T/G)的多态性分布，结果发现： 对+378(T/A)而言，等位基因A和基因型TA以及整合后的基因型TA+AA在两组群体中均表现出显著性差异(P值均为0.001)。对+140(A/T)而言，等位基因T的频率在正常对照中为30.14％，在患者中为36.10％，两者具有显著差异(P=0.009)；纯合突变基因型TT、杂合基因型AT和整合后的基因型(AT+TT)在病人和正常已育人群中的分布都表现出统计学差异(P值分别为0.041、0.020和.009)，提示+140(A/T)可能是特发性男性不育的风险位点。140位点位于脚基因的3’UTR，该位点A→T的突变对RXRB基因可能产生的影响尚不清楚。因此，我们利用荧光素酶表达系统对140位点的SNP进行了初步的功能研究。结果表明，含140TT的表达载体其荧光素酶的活性显著低于含140AA的表达载体(P(0.01)，提示140位点A→T的突变可能影响RXRB蛋白的表达。最后对+7(T/G)位点的研究发现，该位点等位基因的频率和不同基因型的频率在患者和对照中都不存在统计学差异。 因+378(T/A)和+140(A/T)均与男性不育表现出相关性，所以我们对这两个位点进行了联合分析，发现这两个位点具有联合作用，随着等位基因突变个数增多，患病的风险就会增大(P<0.001)。 分析RXRB基因+378(T/A)，+140(A/T)和+7(T/G)构成的单倍型时发现T378/A140/T7为患者和对照组中常见的单倍型，单倍型T378/T140/T7在患者组和对照组中的分布具有统计学差异(p=0.049)，为特发性男性不育的风险单倍型。 第二部分 HSP70基因多态性与特发性男性不育的关系 在患者和正常对照中，我们分别研究了HSP70-1基因+190(G/C)，HSP70-2基因+1267(G/A)和+2074(G/C)以及HSP70-hom基因+2763(G/A)和+2437(C/T)位点多态性与男性不育的关系。结果发现： 对HSP70-1基因+190(G/C)而言，等位基因和基因型频率在患者和对照之间都不存在统计学差异，提示该位点多态性与特发性男性不育没有相关性。对HSP70-2基因G12674A而言，等位基因A的分布在患者和正常对照中具有统计学差异(P=0.034)；基因型GA和整合后的基因型(GA+AA)在病人和正常已育人群中的分布也都表现出显著差异(P值分别为0.004和0.007)，提示：HSP70-2基因G12674A可能为特发性男性不育的风险位点。对HSP70-2基因+2074(G/C)而言，其等位基因的频率和基因型频率在患者和对照之间不存在统计学差异。研究HSP70-hom基因+2763(G/A)和+2437(C/T)在患者和对照中的多态性分布时，发现：对+2763(G/A)位点而言，其等位基因和基因型在患者和对照中的分布没有统计学差异。对+2437(C/T)位点而言，等位基因T和基因型TT以及整合后的基因型TT+CT在两组人群中具统计学差异(P值分别为0.007，0.006和0.033)，提示：HSP70-2基因+2437(C/T)为特发性男性不育的风险位点。 对两个风险位点HSP70-2基因+1267(G/A)和HSP70-hom基因+2437(C/T)进行联合分析，发现这两个位点存在联合作用，随等位基因突变的个数越多，其患病的风险趋势越大，提示在我们的研究群体中，HSP70-2基因+1267(G/A)和HSP70-hom基因+2437(C/T)位点为特发性男性不育的风险位点组合。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

第一章前言

第二章HLA区生精相关基因的SNP与特发性男性不育的关系

第一节RXR基因的单核苷酸多态性与特发性男性不育的相关性研究

材料与方法

结果

本节讨论

第二节HSP70基因的单核苷酸多态性与特发性男性不育的相关性研究

材料与方法

结果

本节讨论

参考文献

全文总结

附录

致谢