硝基还原假单胞菌谷氨酰胺酶基因的克隆、表达及其在L-茶氨酸酶法合成中的应用

摘要

L-茶氨酸(L-Thcanine)是一种茶叶中特有的氨基酸，也是茶叶的主要呈味物质。近年来的很多研究结果证实茶氨酸具有许多有益的生理功能，例如：保护神经、降低血压、抗肿瘤、放松等。因此，茶氨酸的制备与应用受到越来越多人的关注，成为了一个研究热点。谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS；EC3.5.1.2)，是催化L-谷氨酰胺水解成为L-谷氨酸和氨的水解酶。有研究表明某些谷氨酰胺酶在碱性条件下，可以像γ-谷氨酰转肽酶(γ-Glutamyl transpepfidase，γ-GGT；EC2.3.2.2)一样催化L-谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸。由于以往的茶氨酸制备方法存在诸如产率低或副产物多的问题，而研究运用谷氨酰胺酶合成茶氨酸能改善这两个难题。本研究的主要结果如下：
　　1、本实验首次克隆了硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)的谷氨酰胺酶(pnGLS)基因序列。pnGLS基因全长909 bp，编码302个氨基酸。通过氨基酸序列分析，pnGLS与同属的恶臭假单胞菌(P.putida F1)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa UCBPP-PA14)序列同源性分别达到94％、81％，亲缘关系也比较相近。同时，得到的氨基酸序列还具有β-内酰胺酶和青霉素结合蛋白超家族所特有的几个保守的关键性催化位点，进一步证明是pnGLS基因。
　　2、根据获得的序列，设计带酶切位点的专一性引物，PCR扩增基因片段，再连接到pET43.1a载体上构建重组质粒pET43.1a-pnGLS，最后把重组质粒转入到E.coli BL21中，构建重组菌。
　　3、优化了重组菌的表达条件，在起始菌液浓度OD600为0.6时，加入诱导剂1 g/L乳糖在24℃、180 rpm诱导10 h。表达的重组蛋白分子量约99 KDa，占到全菌蛋白的70％以上。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，重组蛋白可溶性很好，几乎不含包涵体。
　　4、运用重组菌粗酶液催化L-谷氨酰胺和乙胺生成茶氨酸，优化了反应条件。5mL体系中，0.3 M谷氨酰胺、1.5 M乙胺、1.5 Utransfer粗酶液、pH10.0，在37℃反应5 h，茶氨酸合成量达到最高，谷氨酰胺的转化率约为40％。为今后进一步构建谷氨酰胺酶工程菌生产茶氨酸提供了依据，也为茶氨酸工业化生产提供广阔前景。

目录

文摘

英文文摘

前 言

第一部分 文献综述

第一章 L-茶氨酸研究概述

1.1 L-茶氨酸的结构与性质

1.2 茶氨酸在体内的吸收与代谢

1.3 茶氨酸的生理功效.

1.4 茶氨酸的开发利用

1.5 茶氨酸的制备

第二章 谷氨酰胺酶研究进展

2.1 谷氨酰胺酶的类型

2.2 谷氨酰胺酶的蛋白结构

2.3 谷氨酰胺酶的应用

第二部分 实验研究

第三章 实验设计方案

3.1 实验目的

3.2 本课题研究内容

3.3 技术路线

第四章 硝基还原假单胞菌谷氨酰胺酶基因的克隆、序列分析

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果与分析

4.4 讨论

第五章 硝基还原假单胞菌谷氨酰胺酶基因的克隆、表达及活性鉴定

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 实验结果与分析

5.4 讨论

第六章 重组谷氨酰胺酶催化合成茶氨酸反应条件优化

6.1 实验材料

6.2 实验方法

6.3 实验结果与分析

6.4 讨论

第七章 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢