中华绒螯蟹螺原体侵染罗氏沼虾血细胞过程中互作蛋白的筛选及功能研究

摘要

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)又称马来西亚大虾、淡水长臂大虾，是世界上个体最大的淡水虾之一，同时也是目前国内主要的三大淡水经济虾类之一。自1976年引入中国以来，该品种在国内的养殖面积逐年扩大、产量逐年增加。然而，随着其养殖规模的不断扩大及集约化程度的提高，一些由细菌、病毒等引起的病害日趋严重，其中还包括新型病原——中华绒螯蟹螺原体。前期研究表明，中华绒螯蟹螺原体通过鳃或体表进入河蟹体内，侵染其靶细胞——小颗粒血细胞，在血细胞中大量繁殖，然后通过血细胞的流通将病原带到机体各器官的结缔组织中，并侵染到神经和肌肉组织，造成病蟹感染前期的无力不食和感染后期的附肢颤抖等病症。但作为一种没有细胞壁的特殊细菌病原是如何黏附、侵染宿主靶细胞?在病原与宿主博弈过程中有哪些关键的蛋白相互作用？
　　本博士学位论文在前期研究的基础上，首先通过相对和绝对定量同位素标记(isobaric tags forrelative and absolute quantitation，iTRAQ)技术，筛选螺原体感染7天后罗氏沼虾血细胞中的差异蛋白，通过蛋白质组学来分析螺原体可能的感染机制以及宿主的防御机理。其次，利用Far-western印记技术筛选罗氏沼虾血细胞的候选受体蛋白，体外细菌结合及激光共聚焦实验对所得到的受体蛋白进行验证，通过合成特异性双链RNA，在罗氏沼虾个体水平研究受体基因功能。最后，利用Far-western印记技术筛选对应螺原体的配体蛋白，体外培养罗氏沼虾血细胞，在细胞水平通过竞争性实验对配体蛋白功能进行研究。本论文为螺原体侵染机理及宿主免疫防御机制的深入研究奠定了良好的基础，本文研究结果主要包括以下6个方面:
　　1.iTRAQ筛选螺原体感染前后罗氏沼虾血细胞的差异蛋白
　　本实验通过iTRAQ的研究，动态、整体、定量地观察螺原体感染前后罗氏沼虾血细胞蛋白质种类、数量的改变。筛选罗氏沼虾血细胞经过螺原体感染后的差异蛋白谱，初步鉴定出具有明确功能的蛋白与结合、催化、结构、转运等分子功能有关。本实验选择差异倍数大于等于1.5的蛋白进行功能分析，实验中筛选出69个具有统计学意义的差异显著蛋白质。上调蛋白中，包括6个免疫相关蛋白，14个生理性蛋白，25个胞内蛋白，4个未知/假设蛋白。下调蛋白中，包括4个免疫相关蛋白，3个骨架蛋白，11个生理性蛋白，2个未知/假设蛋白。选择其中7个蛋白，通过qRT-PCR检测对应mRNA水平的表达变化，结果表明基本与iTRAQ筛选结果保持一致。
　　2.Far-western印迹筛选罗氏沼虾受体蛋白
　　罗氏沼虾血细胞总蛋白经SDS-PAGE分离后转至PVDF膜上，以甲醛固定过的螺原体为覆盖蛋白，然后依次孵育抗螺原体的兔多抗和抗兔的荧光标记二抗。综合Far-western结果，本实验初步从罗氏沼虾血细胞总蛋白中钓取了6种可能与S.eriocheiris相互作用的受体蛋白。根据分子功能，将受体蛋白分为三大类:细胞骨架、先天性免疫系统、信号传导因子。细胞骨架，包括Beta-Actin、Beta-Tubulin及Alpha-Tubulin蛋白。先天性免疫系统，包括LGBP和proPO蛋白。信号传导因子，包括Ran蛋白。
　　3.Beta-Actin蛋白原核表达及受体功能验证
　　在此部分实验中，以Beta-Actin为研究对象通过细菌结合及激光共聚焦实验来验证其作为受体蛋白的可靠性。体外细菌结合实验，将纯化的Beta-Actin重组蛋白与螺原体室温结合2h，然后PBS多次洗脱，最后用8M脲强力洗脱，结果Beta-Actin依然可以结合在螺原体的表面。激光共聚焦结果显示绿色荧光标记的螺原体贴附在红色荧光的Actin蛋白上，两者相互叠加产生黄色荧光，进一步从细胞水平证实Beta-Actin与螺原体存在相互作用。
　　4.LGBP蛋白原核表达及受体功能研究
　　LGBP通常都能够识别并结合脂多糖及β-1，3-葡聚糖，从而参与革兰氏阴性菌和真菌的识别及防御，但是LGBP对于缺乏细胞壁细菌的识别还尚未有过报道。本研究首先重组表达并纯化LGBP蛋白，体外细菌结合实验证实LGBP蛋白能够与螺原体相结合。激光共聚焦实验，采用抗LGBP鼠多抗和Alexa Fluor555标记驴抗小鼠二抗来特异性的标记罗氏沼虾血细胞的LGBP蛋白，结果显示绿色荧光标记的螺原体贴附在红色荧光的LGBP蛋白上。接下来，合成LGBP特异性双链RNA，观察LGBP基因干扰对于螺原体拷贝数和罗氏沼虾存活率的影响。结果表明，螺原体感染后第3天，LGBP dsRNA注射组的罗氏沼虾血细胞中螺原体拷贝数明显少于GFP dsRNA和PBS注射组。罗氏沼虾存活率统计显示，LGBP基因的沉默增加了宿主对螺原体侵染的敏感性，死亡率要高于两个对照组。以上结果表明，LGBP作为胞外受体蛋白参与了螺原体黏附细胞的过程，但是除了LGBP之外应该还有其他的受体蛋白。
　　5.Ran基因克隆、蛋白原核表达及功能研究
　　前期研究表明，对虾和果蝇小G蛋白Ran参与了病毒吞噬过程。本研究进一步探讨Ran介导螺原体的吞噬作用，揭示Ran调控细胞吞噬的分子机制。首先，利用质谱所得肽段序列设计简并引物扩增Ran基因的中间序列，并通过RACE技术扩增得到基因全长。然后，通过体外细菌结合实验证实Ran蛋白能够与螺原体相结合。最后，合成Ran特异性双链RNA，观察Ran基因干扰对于螺原体拷贝数和罗氏沼虾存活率的影响。结果表明MrRan-dsRNA注射组中螺原体拷贝数明显少于对照组，该组中罗氏沼虾存活率也要高于两个对照组。推测罗氏沼虾Ran蛋白作为胞内受体蛋白参与了S.eriocheiris的吞噬过程，MrRan可能参与了吞噬作用中异物摄入过程。
　　6.Far-western印记筛选螺原体配体蛋白及配体蛋白功能验研究
　　通过Far Western印记筛选Beta-Actin及LGBP的配体蛋白，Beta-Actin的候选配体蛋白为转酮醇酶(transketolase)，LGBP蛋白的候选配体蛋白分别为烯醇酶（enolase）、转酮醇酶(transketolase)、乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase)和RNA聚合酶β亚基(DNA directed RNA polymerase subunit beta)。体外培养罗氏沼虾血细胞，螺原体感染之前孵育纯化的重组配体蛋白，结果烯醇酶能够有效抑制螺原体的侵染，罗氏沼虾血细胞存活率提高20个百分点，转酮醇酶和乙醛脱氢酶对血细胞存活率影响不显著。Westem检测表明烯醇酶在螺原体膜蛋白及胞质蛋白中均有分布。我们推测烯醇酶参与了螺原体黏附虾血细胞过程，通过与罗氏沼虾LGBP蛋白的结合促进螺原体的黏附及侵染。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 罗氏沼虾养殖现状及其产业所面临问题

1．1．1 罗氏沼虾养殖现状

1．1．2 罗氏沼虾产业所面临问题

1．2 螺原体研究概述

1．2．1 螺原体的发现与报道

1．2．2 螺原体分类地位及生物学特性研究

1．2．3 螺原体的生物多样性

1．2．4 螺原体侵染机理研究进展

1．3 水产甲壳动物螺原体研究进展

1．3．1 水产甲壳动物螺原体的发现与证实

1．3．2 罗氏沼虾螺原体研究进展

1．3．3 中华绒螯蟹螺原体侵染机理研究

1．4 水产甲壳类动物先天性免疫研究进展

1．4．1 免疫反应的启动

1．4．2 体液免疫

1．4．3 细胞免疫

1．5 小G蛋白研究进展

1．5．1 小G蛋白简介

1．5．2 Ran蛋白结构特点

1．5．3 Ran生物学功能研究

1．6 本论文的研究目的、内容、意义和技术路线

本文主要研究内容

本论文的实验技术路线

第2章 iTRAQ筛选螺原体感染前后罗氏沼虾血细胞的差异蛋白

2．1 材料和方法

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要器材及设备

2．1．3 主要试剂

2．1．4 实验方法

2．2 实验结果

2．2．1 螺原体感染检测

2．2．2 总蛋白浓度测定及电泳检测

2．2．3 蛋白质鉴定结果

2．3 讨论

第3章 Far-western印迹筛选罗氏沼虾受体蛋白

3．1 材料

3．1．1 主要设备

3．1．2 主要试剂

3．2 实验方法

3．2．1 罗氏沼虾血细胞总蛋白提取

3．2．2 螺原体菌液处理

3．2．3 BCA法测定蛋白浓度

3．2．4 Far-western印记筛选罗氏沼虾血细胞受体蛋白

3．2．5 蛋白萃取与质谱鉴定

3．3 实验结果

3．3．1 罗氏沼虾血细胞及螺原体菌液蛋白浓度测定

3．3．2 Far-Western印记筛选宿主受体蛋白

3．3．3 蛋白质谱测序结果

3．4 讨论

第4章 Beta-Actin蛋白原核表达及受体功能验证

4．1 实验材料

4．1．1 主要器材及设备

4．1．2 主要试剂

4．2 实验方法

4．2．1 Beta-Actin基因扩增

4．2．2 Beta-Actin基因与pGEX-6P-1载体连接

4．2．3 pGEX-Beta-Actin连接产物转化至克隆感受态细胞

4．2．4 菌落PCR鉴定阳性克隆、测序分析

4．2．5 重组质粒原核表达

4．2．6 重组蛋白过柱纯化

4．2．7 Western blot分析蛋白纯化结果

4．2．8 Beta-Actin重组蛋白与螺原体体外结合实验

4．2．9 激光共聚焦验证罗氏沼虾血细胞Beta-Actin与螺原体相互作用

4．3 实验结果

4．3．1 Beta-Actin基因扩增

4．3．2 原核表达载体的构建

4．3．3 重组蛋白的表达、纯化与鉴定

4．3．4 重组蛋白与螺原体体外结合

4．3．5 激光共聚焦验证共定位

4．4 讨论

第5章 LGBP蛋白原核表达及受体功能验证

5．1 实验材料

5．1．1 主要器材及设备

5．1．2 主要试剂

5．2 实验方法

5．2．1 LGBP蛋白表达、纯化及验证

5．2．2 抗LGBP鼠多克隆抗体制备

5．2．3 LGBP重组蛋白与螺原体体外结合实验

5．2．4 激光共聚焦验证罗氏沼虾血细胞LGBP与螺原体相互作用

5．2．5 LGBP双链RNA合成及纯化

5．2．6 罗氏沼虾LGBP基因干扰

5．2．7 LGBP基因干扰对于螺原感染的影响

5．2．8 罗氏沼虾死亡率统计

5．2．9 螺原体侵染期间罗氏沼虾LGBP基因衰达变化

5．3 实验结果

5．3．1 LGBP基因扩增

5．3．2 原核表达载体的构建

5．3．3 重组蛋白的表达、纯化与鉴定

5．3．4 重组蛋白与螺原体体外结合

5．3．5 激光共聚焦验证共定位

5．3．6 MrLGBP双链RNA合成

5．3．7 MrLGBP基因干扰效果检测

5．3．8 MrLGBP基因干扰对螺原体侵染数量的影响

5．3．9 MrLGBP基因干扰后感染螺原体统计罗氏沼虾死亡率

5．3．10 MrLGBP基因干扰后感染螺原体检测MrLGBP基因表达变化

5．4 讨论

第6章 Ran基因克隆、蛋白原核表达及功能研究

6．1 实验材料

6．1．1 主要器材及设备

6．1．2 主要试剂

6．2 实验方法

6．2．1 Ran简并引物设计

6．2．2 中间部分cDNA序列扩增

6．2．3 cDNA末端快速扩增技术(RACE)扩增基因全长

6．2．4 Ran蛋白表达、纯化及验证

6．2．5 Ran重组蛋白与螺原体体外结合实验

6．2．6 Ran双链RNA合成及纯化

6．2．7 罗氏沼虾Ran基因干扰

6．2．8 Ran基因干扰对于螺原侵染的影响

6．2．9 罗氏沼虾死亡率统计

6．3 实验结果

6．3．1 Ran简并引物设计及部分cDNA序列扩增

6．3．2 RACE扩增Ran cDNA序列全长

6．3．3 MrRan cDNA序列分析

8．3．4 MrRan蛋白原核表达及纯化

6．3．5 MrRan重组蛋白与螺原体体外结合

6．3．6 MrRan基因干扰效果检测

6．3．7 MrRan基因干扰对螺原体侵染数量的影响

6．3．8 MrRan基因干扰后感染螺原体统计罗氏沼虾死亡率

6．4 讨论

第7章 Far-western印迹筛选螺原体配体蛋白及配体蛋白功能验证

7．1 实验材料

7．1．1 主要器材及设备

7．1．2 主要试剂

7．2 实验方法

7．2．1 中华绒蟹蟹螺原体总蛋白提取

7．2．2 Far-Western印记筛选螺原体配体蛋白

7．2．3 蛋白萃取与质谱鉴定

7．2．4 螺原体基因组DNA的提取

7．2．5 配体蛋白重组表达

7．2．6 配体蛋白竞争性实验

7．2．7 烯醇酶在螺原体不同组分中分布

7．3 实验结果

7．3．1 螺原体总蛋白提取

7．3．2 Far-Western印记筛选螺原体配体蛋白

7．3．3 配体蛋白质谱测序结果

7．3．4 重组质粒碱基突变

7．3．5 重组蛋白的表达、纯化

7．3．6 配体蛋白质竞争性实验

7．3．7 烯醇酶在螺原体中分布情况

7．4 讨论

第8章 结论

8．1．iTRAQ筛选螺原体感染前后罗氏沼虾血细胞的差异蛋白

8．2．Far-western印迹筛选罗氏沼虾受体蛋白

8．3．Beta-Actin蛋白原核表达及受体功能验证

8．4．LGBP蛋白原核表达及受体功能研究

8．5．Ran基因克隆、蛋白原核表达及功能研究

8．6．Far-western印记筛选螺原体配体蛋白及配体蛋白功能验研究

本研究的主要创新点

进一步研究方向

附录

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢