江苏部分地区克氏原螯虾WSSV调查及ELISA检测技术

摘要

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)俗称小龙虾，原产于美国南部和墨西哥北部，后由美国传入日本，上世纪30年代末期由日本引入我国，因其味道鲜美，营养丰富，现己成为我国市场上深受欢迎的水产品，而江苏省是我国主要的克氏原螯虾生产地区，区位优势明显。然而，自2007年5月份开始，在江苏省的徐州、盱眙、淮安、扬州、常州等地先后发生了克氏原螯虾病害，死亡率最高达50％，使克氏原螯虾养殖业遭受了巨大损失，经检测，确定致病原为白斑综合征病毒(WSSV)。
　　白斑综合征病毒(WSSV)是一种具囊膜、杆状的双链环状DNA病毒。由WSSV引起的对虾白斑综合征疾病自1992年首次发现于我国台湾以来，现如今已在世界范围内爆发流行，被世界动物卫生组织(OIE)、联合国粮农组织(FAO)及亚太水产养殖中心网(NACA)列为需要报告的重要水生动物疾病病原之一。虽然在过去20余年，对WSSV的病原学、分子生物学以及致病机理等方面已经有了深入研究，但是目前对由WSSV所引起的疾病尚无有效治疗方法，使得人们在应对它时必须侧重于早期的防控，而这又主要依赖于早期快速的诊断和筛查。
　　本论文通过调查江苏省部分地区养殖克氏原螯虾中白斑综合征的流行状况，获得了第一手数据，并初步纯化出WSSV，制备了WSSV囊膜蛋白VP26和VP28的多克隆抗体，以尝试建立ELISA快速检测技术，便于基层推广应用。
　　1、江苏省部分地区克氏原螯虾WSSV调查
　　2014-2015年江苏省克氏原螯虾养殖持续保持较强地上升势头，养殖面积不断扩大，克氏原螯虾养殖业已逐步成为我省重要的淡水水产支柱产业。但随着养殖业的高速发展，克氏原螯虾暴发性流行病问题日益突出，尤以白斑综合征病毒病感染最为普遍。本课题组与江苏省淡水水产研究所合作，建立了克氏原螯虾WSSV测报系统，按照行业标准SN/T1151.2-2011对虾白斑病检疫技术规范聚合酶链式反应(PCR)检测方法检测，对江苏省南京市、楚州区、姜堰区、盱眙县等部分地区克氏原螯虾WSSV病害情况进行了统计、分析，发现当前白斑综合征病毒病己成为克氏原螯虾养殖业的最主要病害，并呈不断蔓延趋势。
　　2、基于WSSV囊膜蛋白VP26、VP28的ELISA检测技术
　　在目前常用的几种病原检测方法中，酶联免疫吸附(ELISA)试验成本较低、简单实用且灵敏度高、特异性强，而且不需要任何仪器设备，便于生产实际应用，是一种早期诊断的良好方法。本实验成功表达、获取了WSSV的VP26、VP28蛋白;用获取的蛋白免疫新西兰大耳兔制备多克隆抗体;参照已有文献方法提取WSSV;然后通过Western Blotting实验验证了提取的WSSV与制备的VP26、VP28抗体能产生特异性反应;最后，尝试建立检测WSSV的间接ELISA技术，通过性能评价摸索最佳条件，完善ELISA方法。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 克氏原螯虾概述

1．2 白斑综合征病毒(WSSV)研究概况

1．2．1 发现及流行分布

1．2．2 命名与分类地位

1．2．3 形态结构

1．2．4 感染症状

1．2．5 传播途径与寄主范围

1．2．6 基因组及其编码的多肽

1．2．7 检测方法

1．3 酶联免疫吸附试验(ELISA)研究进展

1．3．1 原理

1．3．2 分类

1．3．3 优点与不足

1．3．4 应用

1．4 本论文的研究目的意义、内容与技术路线

1．4．1 研究目的、意义

1．4．2 研究内容

1．4．3 技术路线

第2章 江苏省部分地区克氏原螯虾WSSV调查

2．1 调查对象与方法

2．1．1 调查对象

2．1．2 调查方法

2．2 调查结果

2．2．1 江苏省克氏原螯虾WSSV疫病测报示范区情况统计

2．2．2 江苏省克氏原螯虾WSSV发病情况统计

2．2．3 克氏原螯虾不同组织感染WSSV的情况

2．3 讨论

2．3．1 江苏省克氏原螯虾WSSV病害发病特点与分析

2．3．2 克氏原螯虾WSSV病害防治措施

第3章 基于WSSV囊膜蛋白VP26、VP28的ELISA检测技术

3．1 实验材料

3．1．1 实验仪器与耗材

3．1．2 实验试剂

3．2 实验方法

3．2．1 VP26、VP28蛋白表达

3．2．2 蛋白纯化

3．2．3 蛋白浓缩

3．2．4 蛋白浓度测定

3．2．5 多克隆抗体制备

3．2．6 提取WSSV

3．2．7 Western Blotting

3．2．8 ELISA

3．3 实验结果

3．3．1 蛋白表达

3．3．2 蛋白纯化

3．3．3 蛋白浓缩

3．3．4 WSSV浓度

3．3．5 Western Blotting

3．3．6 ELISA

3．4 讨论

第4章 全文总结

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢