DNA电化学生物传感器在DNA甲基转移酶活性及肿瘤细胞外泌体分析检测中的应用研究

摘要

DNA电化学生物传感器是基于DNA分子中碱基之间的特异性互补配对规律建立起来的一类生物传感器，以循环伏安法、示差脉冲伏安法、方波循环伏安法、交流阻抗法等电化学方法研究传感器电极表面附近的电活性物质的物理化学性质变化，实现对各种目标物的检测分析，是一种新兴的生物传感器。由于DNA电化学生物传感器具有分析速度快、操作简单、灵敏度高、选择性好、重现性好、测试费用低等诸多优点，已经在生命分析科学领域得到了广泛的应用。不仅可以用来检测与疾病相关的特定序列DNA片段，还可用于引起DNA损伤的疾病的研究，并在抗癌药物筛选、临床诊断、环境监测等方面起到越来越重要的作用。本文构建了两种DNA电化学生物传感器，分别实现了对DNA甲基转移酶活性及肿瘤细胞外泌体的分析检测。
　　DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰。DNA甲基化是由DNA甲基移酶催化完成的。在人类细胞中，甲基转移酶(DNMT1)过表达会引起异常DNA甲基化。研究发现，异常DNA甲基化与癌症的发生有着直接的关系。已有研究表明，在人类结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌和肝癌患者细胞中DNMT1都是过表达的。因此，有效的检测甲基转移酶的活性对癌症的研究具有非常重要的意义。我们建立了一种DNA电化学生物传感器来有效的检测癌细胞溶菌样品中甲基转移酶的活性。利用金纳米粒子连接DNA(DNA-complexes)和Ru(NH3)63+与Fe(CN)63-之间产生催化电流实现了信号的双重放大，进而提高了检测的灵敏度。我们对不同癌细胞中DNMT1活性进行了检测和对比，其结果与商品化试剂盒测试结果保持一致。
　　外泌体(exosomes)是活细胞分泌的直径约为30-150nm的膜性囊泡，天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。Exosomes携带了包含细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白及特殊蛋白质，参与细胞活动的重要调控，已经成为多种疾病的早期诊断标志物。Exosomes在基因和药物运载、肿瘤及肿瘤生物学研究方面已经成为热点。研究表明，人前列腺癌细胞的外泌体上存在一种抗原PSMA，此抗原已成为检测前列腺癌的标志物。可以通过检测细胞外泌体是否表达PSMA蛋白，实现对癌症的诊断。本文利用外泌体上的特定抗原蛋白与核酸适配体的特异性结合，结合目标分子循环信号放大作用，构建了DNA电化学生物传感器，成功实现了对人类前列腺癌细胞外泌体的电化学检测。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 DNA电化学生物传感器

1．2．1 DNA电化学生物传感器的构成和工作原理

1．2．2 DNA电化学生物传感器的信号检测

1．2．3 DNA电化学生物传感器的应用

1．2．4 DNA电化学生物传感器的展望

1．3 DNA甲基化

1．3．1 DNA甲基化的分析方法

1．3．2 DNA甲基化分析在癌症诊断和治疗中的应用

1．4 外泌体

1．4．1 外泌体的生物学意义

1．4．2 外泌体的分离与检测

1．5 本论文的指导思想

第二章 基于内切酶特异性剪切的DNA电化学生物传感器检测人类DNA甲基转移酶(DNMT1)的活性

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂

2．2．2 仪器

2．2．4 金纳米粒子连接DNA复合物(Au NP-DNA Complexes)的制备

2．2．5 探针DNA的固定及杂交

2．2．6 电化学表征与检测

2．3．1 DNNT1活性检测的原理

2．3．2 Au NPs和AuNPs-DNA Complexes的表征

2．3．3 实验可行性分析

2．3．4 Au NPs连接的S2、S3的比例优化

2．3．5 DNMT1的活性检测

2．3．6 细胞裂解液中DNMT1的活性检测

2．3．7 DNMT1活性和不同细胞系的DNMT1总蛋白含量评估

2．4 结论

第三章 基于核酸外切酶Ⅲ循环剪切作用辅助信号放大方法检测LNCaP细胞来源的外泌体

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂

3．2．2 仪器

3．2．3 细胞培养和外泌体提取

3．2．4 外泌体的定量

3．2．5 磁珠与Aptamers的连接

3．2．6 探针DNA的固定

3．2．7 外泌体与Aptamers的作用

3．2．8 电化学表征与检测

3．3 结果与讨论

3．3．1 外泌体的TEM表征

3．3．2 Aptamers与MBs连接的紫外吸收表征

3．3．3 实验可行性分析

3．3．4 探针DM浓度优化

3．3．5 核酸外切酶Ⅲ作用时间优化

3．3．6 人前列腺癌细胞外泌体的检测

3．3．7 选择性分析

3．3．8 复杂体系中外泌体的检测

3．4 结论

第四章 结论及主要创新点

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢