铁皮石斛qPCR内参基因的筛选及开花相关基因的表达分析

摘要

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)隶属兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw.)，为中国传统药用植物。因其富含多糖、生物碱、菲类化合物等多种药用成分，拥有生津益胃、润肺止咳、增强免疫力等功效。对关键基因进行功能研究有助于更好地开发利用铁皮石斛，基因的表达分析则是基因功能研究的一个重要方面。目前，基因表达量一般通过荧光定量PCR相对定量的方法进行分析，而稳定的内参基因是qPCR相对定量准确的保障。为了研究铁皮石斛不同组织中、不同生长阶段中及非生物胁迫条件下的功能基因表达，筛选特定试验条件下的最佳内参基因或基因组合是十分必要的。
　　本研究选取了7个常用的内参基因(Actin、18S rRNA、GAPDH、EF-1α、TUA、TUB、UBQ)作为候选基因，通过qPCR绝对定量方法分别比较了铁皮石斛不同组织中（原球茎、根、茎、叶、花、种子）、不同生长阶段以及非生物胁迫条件下（高温、低温和干旱）各候选内参基因的表达差异。随即对获得的数据采用三个内参基因稳定性评估软件geNorm、NormFinder和BestKeeper进行分析，最终筛选到特定试验条件下最合适的内参基因和内参基因数。
　　在铁皮石斛不同组织中，geNorm与NormFinder软件分析结果较为一致，而Bestkeeper软件分析的结果与以上两种软件的分析结果存在差异。geNorm和NormFinder软件分析得出候选内参基因表达稳定性最低者为18S rRNA，最高者为GAPDH。Bestkeeper软件分析得出候选内参基因表达稳定性最低者为TUA，最高者为18S rRNA。此外，依据geNorm软件的配对差异值Vn/n+1，确定该试验所需内参基因的最佳数目是3。综合分析，推荐铁皮石斛不同组织中最佳内参基因组合为EF-1α+Actin+GAPDH。在铁皮石斛不同生长发育阶段，3个软件的分析结果不尽相同，但3个软件分析得出候选内参基因表达稳定性最低者均为TUB，结合geNorm软件推荐的该试验条件下所需内参基因数目是5，同时考虑试验成本和实际可行性，综合推荐基因组合UBQ+GAPDH。
　　在高温(40℃)和低温(4℃)胁迫条件下，geNorm和Bestkeeper软件的分析结果较一致，与NormFinde软件分析结果有所不同。geNorm和Bestkeeper软件分析均得出候选内参基因表达稳定性最低者为TUA，最高者为18S rRNA。NormFinder软件分析得出候选内参基因表达稳定性最低者为GAPDH,最高者为Actin。结合geNorm软件推荐的该试验条件下所需内参基因是5，同时考虑试验成本和实际可行性，综合推荐基因组合为TUB+18SrRNA。在干旱胁迫条件下，3个内参基因稳定性评估软件的分析结果较一致。3个软件分析均得出候选内参基因表达稳定性最低者为TUA。结合geNorm软件推荐的所需内参基因数目2，综合推荐基因组合18S rRNA+Actin。
　　分别利用筛选得到的最不稳定内参基因和最佳内参基因组合相对定量异戊二烯代谢途径中的关键基因法昵基焦磷酸合酶基因FPS在不同组织和不同生长发育阶段的表达模式。FPS的表达具有组织特异性的特点，在原球茎和种子中表达最高，叶中最低。FPS的表达在不同生长发育阶段存在差异，均呈现先增加后降低的趋势。同时通过绝对定量方法对FPS在上述的试验样品中表达进行分析。不但验证了筛选到的铁皮石斛特定试验条件下最佳内参基因的准确性，而且也探究了FPS在铁皮石斛不同组织中和不同生长发育阶段中的表达模式。
　　基于铁皮石斛基因组，成功克隆了7个共5类铁皮石斛开花相关的MADS-box基因(FUL、PI、AP3、AG1、AG2、SEP3、AP1)并对其在铁皮石斛花芽、正常花和畸形花中的基因表达进行检测。试验结果显示6个开花相关基因在三种材料中均表达，但表达模式却不相同。开花相关基因在开花过程中表达量显著增强，除AP1外，在畸形花中表达量均显著降低。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 qPCR技术原理及应用进展

1．1．1 qPCR技术

1．1．2 qPCR应用进展

1．2 内参基因的研究现状

1．2．1 内参基因简介

1．2．2 常用的内参基因

1．2．3 内参基因筛选的方法

1．2．4 内参基因的应用

1．3 兰科植物开花研究进展

1．3．1 兰科植物试管开花研究现状

1．3．2 植物成花的分子调控

1．3．3 植物花的发端

1．3．4 植物花器官的发育

1．4 研究目的与意义

第2章 铁皮石斛候选内参基因克隆与qPCR标准体系的建立

2．1 引言

2．2 材料

2．2．1 植物材料

2．2．2 主要试剂

2．2．3 常用溶液配方

2．2．4 主要仪器设备

2．3．1 总RNA的提取及cDNA第一条链的合成

2．3．2 内参基因的选择和引物设计

2．3．3 候选内参基因的PCR扩增

2．3．4 目的片段的回收、连接和转化

2．3．5 菌液PCR检测和测序

2．3．6 标准品的制备

2．3．7 标准曲线的制备及引物扩增效率的测定

2．4 结果与分析

2．4．1 铁皮石斛总RNA的质量检测

2．4．2 候选内参基因克隆

2．4．3 内参基因荧光定量PCR分析

2．5 讨论

2．5．1 铁皮石斛候选内参基因的克隆

2．5．2 qPCR标准体系的建立

第3章 铁皮石斛不同组织和不同生长阶段内参基因的筛选

3．1 引言

3．2 材料

3．2．1 植物材料

3．2．2 主要试剂和仪器设备

3．2．3 三种内参基因表达稳定性评估软件

3．3 实验方法

3．3．2 标准曲线的制备及引物扩增效率的测定

3．3．3 内参基因稳定性分析

3．4 结果与分析

3．4．1 六种不同组织中候选内参基因表达稳定性分析

3．4．2 不同生长阶段内参基因表达稳定性分析

3．4．3 用FPS在铁皮石斛不同组织中与生长阶段中的荧光定量分析

3．5 讨论

3．5．1 铁皮石斛不同组织中和不同生长阶段内参基因的筛选

3．5．2 三个内参基因表达稳定性评估软件

3．5．3 FPS在不同组织和不同生长发育阶段的表达分析

第4章 铁皮石斛非生物胁迫条件下内参基因的筛选

4．1 引言

4．2 材料

4．2．1 植物材料

4．2．2 主要试剂和仪器设备

4．3 实验方法

4．3．3 内参基因稳定性分析

4．4 结果与分析

4．4．1 温度胁迫条件下内参基因表达稳定性分析

4．4．2 干旱胁迫条件下内参基因稳定性分析

4．5 讨论

第5章 铁皮石斛开花相关基因的表达分析

5．1 引言

5．3．2 铁皮石斛开花相关基因的克隆

5．3．3 铁皮石斛开花相关基因的荧光定量PCR分析

5．4．1 多激素诱导铁皮石斛开花

5．4．2 铁皮石斛开花相关基因的克隆

5．4．3 铁皮石斛开花相关基因的荧光定量PCR分析

5．5 讨论

第6章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢