太湖沉积物厌氧氨氧化细菌分布、多样性及其活性研究

摘要

厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation，anammox)过程是近二十年来颠覆人们对微生物氮循环认识的重要过程之一(Jetten et al.2009)。一直以来，人们普遍认为反硝化过程是唯一能够产生氮气的微生物过程。Anammox过程的发现不仅证实了存在氧化NH4+同时还原NO2-产生氮气的理论依据(Mulder et al1995)，而且为新的废水脱氮工艺的开发与应用提供了可能(Kartal et al.2010)。目前研究发现，anammox细菌广泛存在于海洋，陆地、淡水等各种各样的自然生态系统中(Humbert et al.2010，Hu etal2011)，但是anammox细菌在富营养湖泊的沉积物环境中的分布、群落组成、多样性和氮转化速率仍不全面，其主要环境驱动因子尚需探明。
　　本研究选取富营养湖泊太湖的沉积物作为研究对象，探究不同湖区不同深度的0-10cm沉积物中anammox细菌的水平和垂直分布特征，并分析其主要环境驱动因子。本研究采用微电极系统测定沉积物柱中DO(dissolved oxygen)、Eh(oxidation-reduction potential)等理化性质，采用定量qPCR(Quantitative PCR)测定相关微生物的基因丰度，采用Illumina Miseq高通量测序、DGGE图谱等技术手段测定和计算相关微生物的群落结构和多样性特征，并采用15N同位素标记技术测定沉积物中anammox过程和反硝化过程的N转化速率，以期综合评价富营养的太湖沉积物中anammox细菌的分子生态学和活性特征受营养水平、植被类型和沉积物环境的影响。主要结果如下:
　　(1)对太湖三个湖区梅梁湾(ML)、贡湖湾(GH)和胥口湾(XK)0-10cm沉积物中的anammox细菌丰度、AOA丰度和AOB丰度研究结果显示:anammox细菌、AOA和AOB丰度均呈现0-5cm泥层显著高于5-10cm泥层的趋势。此外，ML样点的anammox细菌和AOB丰度均显著高于其他两个样点，而ML样点的AOA丰度显著低于其他两个样点。回归分析显示沉积物中TN、NH4+-N和TOC含量对anammox细菌丰度，DOC和TOC含量对AOA丰度，TN和NO2--N含量对AOB丰度均有显著影响。太湖不同湖区沉积物中anammox细菌和AOB的群落结构也存在样点差异，其中ML样点与其他两个样点的差异性最大。TN含量、NO2--N含量、pH值、TOC/TN和DOC含量是影响anammox群落和AOB群落分布不可忽视的重要因子。总之，0-5cm深度的表层沉积物是具有氨氧化功能的微生物集中区域;相比湖泊类型，营养水平可能对anammox细菌和好氧氨氧化菌的分布和群落影响更强烈。
　　(2)对太湖梅梁湾(HN)和湖心(LN)样点沉积物中anammox细菌垂直分布特征研究结果显示，在LN样点中anammox细菌相对丰度随着深度的增加而出现先增加后降低的趋势，在2-4cm深度处达到峰值;而在HN样点anammox细菌相对丰度则随深度变化趋势不显著。另外，群落组成分析结果表明Candidatus Brocadia spp.占anammox细菌总量的83.5-100％，是沉积物中最主要的anammox细菌属。而Candidatus Kuenenia spp.虽然在LN样点各深度均被检出，但在HN样点只分布在沉积物4-5cm深度处。回归分析和RDA分析指出TN和NH4+-N含量是影响anammox细菌的相对丰度和群落组成最关键的因子。此外，anammox细菌的多样性指数存在显著的样点差异，多样性主要DOC、TOC、NH4+-N和pH等因素影响。总之，N素营养水平会强烈影响沉积物柱中anammox细菌相对丰度和群落结构的垂直分布。
　　(3)太湖不同湖区沉积物中anammox速率为4.3±2.9nmol N2g-1h-1至30.3±11.5nmol N2g-1h-1，显著高于沉积物中反硝化速率，沉积物anammox速率在不同湖区之间差异不显著。我们推测前者与沉积物中NH4+-N、温度和TOC/TN具有很大联系，而后者则与湖泊内部的异质性有关。此外，碳源和pH控制实验结果也显示强酸条件和添加碳源对anammox速率具有明显的抑制作用，而强碱条件对anammox速率具有促进作用。所以，我们推断在较低碳含量的碱性湖泊沉积物中anammox细菌可能承担着更重要的脱氮作用。

目录

声明

摘要

第1章绪论

1．1厌氧氨氧化作用研究进展

1．1．1厌氧氨氧化的发现

1．1．2厌氧氨氧化过程机理

1．2厌氧氨氧化细菌研究进展

1．2．1生理生化特征

1．2．2环境分布特征

1．2．3多样性研究方法进展

1．2．4群落影响因素

1．3厌氧氨氧化速率活性研究手段及方法学进展

1．3．1厌氧氨氧化速率

1．3．2研究方法与机理

1．3．3厌氧氨氧化活性影响因素

1．4本研究的内容与意义

1．4．1研究背景及意义

1．4．2研究内容与研究目标

1．4．3拟解决的关键科学问题

1．4．4技术路线

第2章太湖不同湖区沉积物中厌氧氨氧化细菌的水平分布特征及多样性

2．1前言

2．2材料与方法

2．2．1采样地概况及样品采集

2．2．2沉积物理化性质分析

2．2．3沉积物DNA提取

2．2．4厌氧和好氧氨氧化菌功能基因定量

2．2．5高通量测序和DGGE图谱分析

2．2．6数据统计分析

2．3结果与分析

2．3．1不同湖区沉积物理化性质

2．3．2不同湖区沉积物厌氧和好氧氨氧化菌的基因丰度

2．3．3不同湖区沉积物厌氧氨氧化细菌相对丰度

2．3．4不同湖区沉积物氨氧化微生物丰度与环境因子关系性

2．3．5不同湖区沉积物厌氧和好氧氨氧化细菌群落结构和聚类分析

2．3．6不同湖区沉积物中厌氧和好氧氨氧化菌群落与环境因子的关系

2．4讨论

2．4．1不同湖区沉积物中厌氧和好氧氨氧化菌的丰度特征

2．4．2不同湖区沉积物中厌氧氨氧化细菌的群落分布特征

2．5结论

第3章太湖沉积物柱中厌氧氨氧化细菌的垂直分布特征与多样性

3．1前言

3．2材料与方法

3．2．1采样地概况及样品采集

3．2．2沉积物理化性质分析

3．2．3沉积物DNA提取

3．2．4功能基因及16S rRNA基因定量

3．2．5高通量测序和生信分析

3．2．6数据统计分析

3．3结果与分析

3．3．1沉积物理化性质的垂直变化

3．3．2沉积物厌氧氨氧化细菌功能基因丰度垂直变化

3．3．3沉积物厌氧氨氧化细菌群落组成的垂直变化

3．3．4沉积物厌氧氨氧化细菌多样性的垂直变化

3．3．5环境因子与沉积物厌氧氨氧化细菌丰度、群落和多样性的关系

3．4讨论

3．4．1太湖沉积物中厌氧氨氧化细菌丰度垂直变化特征

3．4．2太湖沉积物中厌氧氨氧化细菌群落的垂直变化特征

3．5小结

第4章太湖沉积物厌氧氨氧化活性及其对环境因子的响应

4．1前言

4．2材料与方法

4．2．1样品采集

4．2．2沉积物理化性质分析

4．2．3沉积物好氧氨氧化速率的测定

4．2．4沉积物厌氧氨氧化速率和反硝化速率的测定

4．2．5 pH值响应实验

4．2．6碳源响应实验

4．3结果与分析

4．3．1太湖沉积物的好氧氨氧化速率

4．3．2太湖沉积物的厌氧氨氧化速率和反硝化速率

4．3．3太湖沉积物中厌氧氨氧化对N素转化的贡献

4．3．4氨氧化速率、反硝化速率与环境因子的关系

4．3．5太湖沉积物厌氧氨氧化活性对pH值的响应

4．3．6添加碳源对厌氧氨氧化速率的影响

4．3．7添加碳源对N2O和CO2浓度的影响

4．4讨论

4．4．1太湖沉积物中厌氧氨氧化速率与好氧氨氧化的关系

4．4．2太湖沉积物中厌氧氨氧化活性对N素转化的贡献

4．4．3太湖沉积物中厌氧氨氧化活性对环境因子的响应

4．5结论

第5章总结及展望

5．1总结

5．2研究特色与创新点

5．3不足与展望

参考文献

附录

致谢