表达禽流感病毒H5血凝素禽腺病毒重组体的构建及其特性研究

摘要

腺病毒因其粘膜免疫优势而被应用于病毒载体的研究中。鸭腺病毒1型病毒是产蛋下降综合征病毒（EDSV）或类似该病毒的一类腺病毒，它的宿主范围很广，致病力相差很大。选用无致病力的鸭腺病毒1型病毒作为载体在基因药物上具有很大的潜力。高致病性禽流感病毒（AIV）感染禽群发病急，应用全病毒灭活疫苗刺激产生的抗体极为缓慢，且不利于疫情抗体监测。AIV表面结构蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶决定了疫苗的免疫效力，很显然，禽流感基因工程标记性疫苗的研究是一个很好的方向。本文通过生物学特性和病毒纤突蛋白分析，筛选到一株低致病力的鸭腺病毒1型病毒，通过突变分析确定了其复制非必需区。AIV的HA是病毒重要的保护性抗原，将其作为靶蛋白构建重组禽腺病毒载体疫苗，并利用Cre-loxP系统的位点特异性重组特性将重组病毒基因组中的GFP报告基因自动敲除，最终获得了只含H5血凝素基因表达盒的禽腺病毒重组体疫苗。同时建立了相应的鉴别重组病毒疫苗与野外感染的AIV或引起产蛋下降的EDSV的核酸检测方法。本文研究主要从以下几个方面展开：
　　 1.禽腺病毒QU分离株的生物学特性及纤突蛋白分析
　　 将鸽鹑源腺病毒QU分离株的纤突蛋白基因进行扩增克隆测序，结果显示与鸡源HS株和AV127株腺病毒的同源性极高.该病毒接种雏鸡未出现临床病症及生长障碍，不致死鸡胚，对鸭胚的致死率明显比引起产蛋下降的HS株低。病毒在鸡胚肝细胞，鸭胚成纤维细胞及鸡胚成纤维细胞上生长良好，且在鸡胚肝细胞上的增殖滴度最高。结果表明该毒株系一株类似产蛋下降综合征病毒的低毒力腺病毒毒株，可以用作禽用基因疫苗或基因治疗的候选病毒载体。
　　 2.禽腺病毒QU株基因组突变分析
　　 参照鸭腺病毒1型病毒基因组右侧E4区附近序列设计引物，扩增出禽腺病毒QU株DNA的2.7kb片段。将pEGFP-C1质粒上含绿色荧光蛋白基因表达盒的MluⅠ/AseⅠ酶切片段插入QU DNA扩增片段的BglⅡ/StuⅠ酶切位点，构建了含GFP基因的转移质粒载体pADGFP。用脂质体将其与QU株共转染CEF细胞，用96孔板稀释法筛选得到纯化的表达绿色荧光蛋白的重组QU病毒株rOUGFP。该重组病毒的复制效率与亲本毒一致，连续传代后病毒滴度稳定。结果表明，QU株基因组右侧的E4附近区域为病毒的1个复制非必需区。
　　 3.禽流感病毒H5血凝素基因检测方法的建立
　　 参照AIV的HA基因序列设计1对引物，对H5亚型AIV核酸进行了扩增，产物大小为176bp。经测试，该引物不与新城疫病毒等鸡的其它传染性病原及鸡肌肉组织的核酸发生交叉反应。敏感性分析发现，从50pg的AIV总RNA中亦能扩增到目的条带。此次建立的方法可以方便地用于以后的AIV血凝素重组禽腺病毒构建的筛选纯化。同时，此对引物亦可扩增到H9亚型AIV的血凝素基因的579bp大小的片段，适用于在一次反应中同时将H9和H5亚型AIV进行快速鉴别。
　　 4.表达禽流感病毒H5血凝素的禽腺病毒重组体的构建
　　 将AIV H5血凝素基因插入鸭腺病毒1型QU株基因组，构建了H5血凝素重组禽腺病毒疫苗。利用pEGFP-C1质粒的CMV启动子和polyA尾信号序列，将禽流感病毒H5血凝素全基因的RT-PCR扩增片段插入其中构建了H5血凝素基因表达盒pHAE。通过PCR延伸获得了一段含双loxP的序列，并将GFP表达盒基因插入其中得到了loxP-GFP-loxP顺序的报告基因pLOXH。将pHAE和pLOXH的表达盒片段串连插入pAD16中，构建了含H5血凝素和GFP表达盒的转移质粒载体pHAGFP。在脂质体介导下将其与病毒DNA共转粢CEF细胞，获得了表达H5和GFP的腺病毒重组体rQUHAGFP。通过二次转染，利用Cre-loxP位点特异性重组自动敲除了重组病毒中的GFP基因，最终获得了只含H5血凝素基因表达盒的重组腺病毒rQUHA。试验结果表明，rQUHA的一步生长曲线与亲本毒QU一样，经过连续传代后重组病毒仍然稳定复制并表达HA血凝素。
　　 5.禽流感病毒H5血凝素重组禽腺病毒的免疫及监测
　　 对AIV H5血凝素重组禽腺病毒疫苗的免疫效力进行了测试。将SPF鸡经口鼻途径分别接种rQUHA重组病毒和QU株病毒，免疫6d后重组病毒免疫鸡群的抗AIV和鸭腺病毒1型病毒抗体开始上升，12d后分别达到5.3log2和7.5log2，此时QU株免疫鸡群的抗腺病毒HI抗体滴度达7.5log2。结果表明，重组病毒可以刺激机体产生HA特异抗体，而自身的HI抗体产生水平未受影响。根据AIV核蛋白基因序列和禽腺病毒的目的基因插入位置的缺失序列设计引物，对鸭腺病毒1型和AIV的特异扩增片段分别为151bp和219bp，建立了AIV的一步法RT-PCR和鸭腺病毒1型的PCR检测方法，利于禽群中使用的重组禽腺病毒疫苗与野外感染的AIV或EDSV快速鉴别。

目录

文摘

英文文摘

图表目录

符号及缩略语

第一章 禽腺病毒研究进展

1 病毒分类

2 形态学

3 基因组结构和复制

4 核酸检测技术研究

5 作为疫苗病毒载体

6 结语

参考文献

第二章 禽病毒载体活疫苗研究进展

1 禽痘病毒载体

2 马立克氏病毒载体

3 禽腺病毒载体

4 新城疫病毒载体

5 结语

参考文献

第三章 禽流感病毒的诊断与免疫研究进展

1 病原学

2 诊断技术研究

3 禽流感的免疫

4 展望

参考文献

第四章 禽腺病毒QU株的生物学特性及纤突蛋白分析

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

ABSTRACT

第五章 禽腺病毒QU株基因组突变分析

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

ABSTRACT

第六章 禽流感病毒H5血凝素基因检测方法的建立

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

ABSTRACT

第七章 表达禽流感病毒H5血凝素的禽腺病毒重组体的构建

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

ABSTRACT

第八章 禽流感病毒H5血凝素重组禽腺病毒的免疫及监测

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

ABSTRACT

全文总结

致谢

攻读学位期间发表的学术论文