猪流感病毒模拟抗原与大肠杆菌热敏性肠毒素B亚基融合表达及小鼠免疫试验

摘要

猪流感(Swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的一种猪的急性呼吸道传染病，一年四季均可发生，各种日龄的猪都可感染。目前对猪流感尚元有效的治疗手段，临床上主要通过疫苗接种预防该病。SI的商品化灭活疫苗主要是H1NI型和H3N2亚型单价或双价全病毒灭活疫苗。但由于近年来重组毒株频繁出现，以传统流行株为毒种的灭活疫苗已无法提供理想的保护作用，因此人们开始对SIV进行新型疫苗研究，以适应SIV高度变异的特性。猪流感病毒(swine influenza virus，SIV)是经上呼吸道粘膜进入机体引起感染的，因此黏膜免疫接种是预防SIV感染最佳免疫途径。大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-labile enterotoxin，LT)B亚基具有良好的黏膜佐剂功能。 本研究利用计算模拟分析SIV主要保护性抗原蛋白血凝素(Heamagglutinin，HA)核苷酸序列，结合HA蛋白空间结构，筛选SIV T、B抗原表位，并通过设计接头将表位片段串联，将该模拟表位串联于大肠杆菌热敏性肠毒素B亚基N端，并定向克隆到原核表达载体pET-30a(+)中，在融合基因下游设计了终止密码子，以及未有终止密码子两种形式，分别命名为pET-30a-EL1争pET-30a-EL2。经测序鉴定阅读框正确后，转化宿主菌BL21(DE3)中，以1mM IPTG诱导，目的片段获得成功表达。SDS-PA～GE电泳，表达重组蛋白分别为33KD和38KD，与预期大小相相符。重组蛋白大量表达，经Ni2+亲和层析柱纯化后，得到单一的目的条带。免疫转印试验显示，重组蛋白可以与His-tag抗体发生免疫学反应，表明表达重组蛋白为构建的目的蛋白，蛋白命名EL1、EL2。经BCA蛋白定量试剂盒分析，蛋白浓度分别为1158.88μg/mL和1245.90μg/mL。 纯化后的EL1、EL2蛋白分别采用肌肉，皮下和滴鼻方式免疫8周龄KM小鼠，间隔10-15天分别进行二免，三免。二、三免后，采血及鼻洗液，用间接ELISA检测血清及局部粘膜抗体、血凝抑制试验检测血清中抗猪流感病毒抗体、T淋巴细胞增殖检测小鼠外周血淋巴细胞增殖情况。通过ELISA方阵滴定试验确定最佳检测条件：血清抗体检测，EL1蛋白包被抗原浓度1:16(62.5ng/孔)，血清样品1：80稀释；EL2蛋白抗原最佳包被浓度1μg/孔，血清1:160稀释。鼻洗液样品检测，EL1抗原包被浓度15.6ng/孔，洗鼻液样品1：3稀释：EL2抗原包被浓度1μg/孔，洗鼻液样品1：3稀释。 三免后，血清学检测结果：EL1肌肉免疫组、EL1皮下免疫组血清IgG达较高水平，滴度达到1:10000以上；而EL1滴鼻组血清抗体水平较低；肌肉、皮下组与滴鼻组/PBS对照组差异极显著(P＜0.01)，而EL1滴鼻组与PBS组无显著性差异(P＞0.05)。EL2各免疫组血清IgG抗体与PBs组差异均极显著(P＜0.01)。但不同免疫组之间差异也极显著(P＜0.01)。局部粘膜分泌型IgA抗体检测，EL1滴鼻组粘膜IgA抗体水平一直较低，与PBS组比较无显著性差异(P＞0.05)。但EL2滴鼻免疫组产生了较好的局部粘膜反应，IgA水平与PBS组差异显著(P＜0.01)。采用MTT法检测免疫小鼠外周血T淋巴细胞增殖情况，所有免疫组均检测到淋巴细胞增殖，与对照组相比，差异极显著(P＜0.01)；EL2不同处理组间也差异显著(P＜0.01)，EL2滴鼻组T细胞增殖最明显。HI试验检测猪流感病毒血凝抗体，肌肉、皮下处理组，抗SIV H3N2亚型HI效价均达1：256以上，EL2滴鼻组的HI效价达1：32；但EL1蛋白滴鼻免疫组的HI效价较低，只有1：4，这与ELISA检测的结果相一致。 上述结果表明，所构建的融合蛋白获得很好的表达，EL2重组蛋白无论以何种途径免疫小鼠，均产生较好的体液免疫反应和细胞免疫反应，其中滴鼻免疫还获得了理想的局部免疫分泌型IgA抗体，为阻止病毒由黏膜途径感染提供了有力的保护屏障，为SIV表位疫苗研制奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

上篇文献综述

第一章猪流感病毒研究进展

1猪流感病毒特性

2猪流感病毒编码蛋白及其功能

3猪流感病毒的流行病学

4猪流感病毒的种间传播

5猪流感病毒的诊断

6猪流感病毒疫苗研制

参考文献

第二章大肠杆菌热敏性肠毒素的研究进展

1 LT的分子结构及生物学特性

2 LT蛋白功能

3 LTB作为免疫佐剂的研究

参考文献

下篇试验研究

第一章猪流感病毒模拟抗原与大肠杆菌热敏性肠毒素B亚基融合表达

摘要

引言

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

第二章重组表达蛋白小鼠免疫活性研究

摘要

引言

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

全文总结

附录:常用试剂的配制

致谢