精噁唑禾草灵和氰氟草酯酶联免疫吸附测定方法研究

摘要

本研究以精噁唑禾草灵和氰氟草酯为研究对象，合成了精噁唑禾草灵半抗原Hapten-1和氰氟草酯半抗原Hapten-2。采用碳二亚胺法和活性酯法将半抗原分别与载体蛋白BSA和OVA共价偶联，制备人工抗原，经紫外分析确定偶联成功，Hapten-1与BSA和OVA偶联比分別为：15:1和8:1，Hapten-2与BSA和OVA偶联比分别为16:1和7:1。以Hapten-1-BSA和Hapten-2-BSA为免疫原免疫雄性新西兰大白兔，分别获得了针对精噁唑禾草灵和氰氟草酯的特异性抗血清，以硫酸铵分步盐析法分离抗血清中的抗体并冷冻干燥得抗精噁唑禾草灵抗体Ab1和抗氰氟草酯抗体Ab2冻干粉，间接竞争酶联免疫吸附测定法（ic-ELISA）测定冻干粉的效价分别为1.02×106和5.12×105。进一步研究了有机溶剂、pH值和离子强度在间接竞争ELISA中对精噁唑禾草灵和氰氟草酯与抗体亲和作用的影响，确定了10％的甲醇和pH7.5、0.3mol/l钠离子强度的磷酸盐缓冲液为精噁唑禾草灵和氰氟草酯间接竞争酶联免疫吸附分析方法的最佳工作条件。
　　 利用制备的抗体，在优化条件下分别建立精噁唑禾草灵和氰氟草酯ic-ELISA方法。精噁唑禾草灵ic-ELISA抑制反应曲线在0.005～5mg/L标样浓度范围与抑制率有较好线性关系，标准曲线的回归方程为I=0.3567 log c+0.8835（I为抑制率，c为农药浓度，R2=0.9922），IC50为0.0844±0.012 mg/L，最低检测限（IC10）为0.0064±0.002 mg/L，制备的抗精噁唑禾草灵抗体与其他结构类似的芳氧苯氧丙酸酯除草剂，除噁唑酰草胺外，交叉反应很小。氰氟草酯ic-ELISA抑制反应曲线在0.005～5mg/L标样浓度范围与抑制率有较好线性关系，标准曲线的回归方程为I=0.2933 log c+0.8438（I为抑制率，c为农药浓度，R2=0.9729），IC50为0.0674±0.004 mg/L，最低检测限（IC10）为0.003±0.0001 mg/L，制备的抗氰氟草酯抗体与其他结构类似的芳氧苯氧丙酸酯除草剂没有交叉反应。
　　 以建立的两种ELISA分析方法，对土壤和水做了添加回收率试验，添加浓度为0.01mg/L（mg/kg）～5 mg/L（mg/kg），ic-ELISA法测定土壤中精噁唑禾草灵的添加回收率为81.82％～110.56％，变异系数为0.85％～3.16％，在田间灌溉水中的添加回收率为83.16％～98.06％之间，变异系数为0.97％～6.25％；氰氟草酯ic-ELISA法在土壤中的添加回收率为80.1％～104.0％之间，变异系数为0.7％～3.3％，田间灌溉水的添加回收率为91.3％～115.5％，变异系数为1.4％～8.3％，均符合农残分析的要求。
　　 本研究建立了精噁唑禾草灵和氰氟草酯ic-ELISA法。在灵敏度、特异性和简便性等方面较理化分析具有明显的优势。为进一步研究开发试剂盒奠定基础，可适用于大量样本和现场样本的快速检测。

目录

文摘

英文文摘

缩略语

第一章 文献综述

1.农药残留及其危害

1.1 农药残留

1.2 农药残留的危害

1.3 农药残留检测方法研究进展

2.农药酶联免疫吸附测定法(ELISA)的研究进展

2.1 农药酶联免疫方法

2.2 农药小分子化合物的免疫分析技术

3.除草剂酶联免疫分析研究进展

3.1 磺酰脲类除草剂半抗原的合成

3.2 芳氧苯氧羧酸类除草剂半抗原的合成

3.3 三氮苯类除草剂半抗原的合成

3.4 取代脲类除草剂半抗原的合成

3.5 其他类除草剂半抗原的合成

3.6 讨论

4.本研究目的、意义和方法

第二章 精噁唑禾草灵ELISA方法研究

1.概述

2.试验材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

3.结果与分析

3.1 半抗原Haptcn-1分子的结构鉴定

3.2 人工抗原的紫外光谱鉴定与结合比

3.3 多克隆抗体的制备及效价

3.4 抗体及包被原工作浓度的确定

3.5 ic-ELISA分析条件的优化

3.6 标准曲线的建立

3.7 抗体特异性分析

3.8 水和土壤中精噁唑禾草灵的回收率

4.讨论

4.1 半抗原的设计

4.2 偶联比和最佳工作浓度的确定

4.3 ic-ELISA分析条件的影响

4.4 抗体的特异性分析

4.5 水样和土壤中精噁唑禾草灵的ic-ELISA分析

第三章 氰氟草酯ELISA方法研究

1.概述

2.材料与方法

2.1 材料与仪器

2.2 试验方法

3.结果与分析

3.1 半抗原的结构分析与鉴定

3.2 人工抗原及结合比的测定

3.3 抗体的效价

3.4 抗体及包被原工作浓度的确定

3.5 ic-ELISA分析条件的优化

3.6 标准曲线的建立

3.7 抗体特异性分析

3.8 水和土壤中氰氟草酯的回收率

4.讨论

4.1 人工抗原的设计

4.2 半抗原与载体蛋白结合比和抗体与包被抗原最适工作浓度

4.3 分析条件对ic-ELISA的影响

4.4 抗体的特异性分析

4.5 不同水样和土壤中氰氟草酯的ic-ELISA分析

全文主要结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文

课题基金项目