外源钙提高黄瓜幼苗低氧胁迫耐性的酶及蛋白基础研究

摘要

无土栽培中水培营养液供氧不足或基质培根垫的形成均会造成低氧逆境,影响植株正常生长发育,成为困扰无土栽培技术大规模应用于生产的限制性因子。因此,提高植株在低氧胁迫下的耐性和抗性对农业生产具有重要的意义。钙是植物生长发育必需的营养元素,是细胞壁、细胞膜结构的重要组分,对维持细胞膜、细胞壁和膜结合蛋白的稳定性,调节无机离子的运输等方面起着至关重要的作用。研究表明,外源钙对低氧胁迫下植物呼吸作用、碳代谢和光合作用具有一定的生理调节作用,然而,关于外源钙对低氧胁迫下植物相关酶蛋白质和特异基因表达的影响尚不清楚。因此,本文以‘新泰密刺’黄瓜(Cucumis sativus L.)品种为试材,采用营养液栽培的方法,通过营养液中添加外源钙和钙离子通道抑制剂,研究了低氧胁迫下钙与黄瓜幼苗根系蛋白质组和呼吸相关酶基因表达之间的关系,探讨了钙在黄瓜植株适应低氧胁迫中的作用机制。主要研究结果如下:
　　 根际低氧胁迫显著抑制了黄瓜植株的生长,鲜重和干重显著低于对照；营养液添加2—6 mmol·L-1Ca2+促进黄瓜植株的生长,缓解低氧胁迫对植株生长的抑制作用,其中以营养液添加4 mmol·L-1 Ca2+缓解胁迫伤害的效果最显著。
　　 与对照相比,常钙低氧胁迫处理的黄瓜幼苗根系SOD和CAT同工酶活性先降低再升高,POD同工酶活性则持续升高；营养液增施4mmol·L-1 CaCl2缓解了低氧胁迫对黄瓜植株的伤害,SOD、POD和CAT同工酶活性接近对照水平；与常钙低氧处理相比,营养液增施50μmol·L-1钙通道抑制剂LaCl3显著抑制了幼苗根系SOD、POD和CAT同工酶活性的升高；营养液增施20μmol·L-1钙调素拮抗剂三氟拉嗪(TFP)引起植株根系SOD、POD和CAT同工酶表达量的剧烈波动,SOD和CAT同工酶先迅速升高,再迅速降低,POD同工酶活性随胁迫时间的延长迅速降低。暗示外源Ca2+增加了Ca2+向植株体内的运输,促进了低氧逆境胁迫信号向体内的传递,提高了根系保护酶的表达量及其活性氧清除水平,从而增强了黄瓜植株耐低氧胁迫的能力。
　　 低氧胁迫诱导产生了新的ADH和LDH同工酶条带,ADH、LDH同工酶丰度和活性显著高于对照；营养液添加 CaCl2缓解了低氧胁迫对黄瓜植株的伤害,ADH、LDH同工酶丰度和活性接近对照水平；营养液添加LaCl3显著抑制了ADH和LDH同工酶丰度和酶活性,黄瓜幼苗植株生长受到抑制,生物量显著低于常钙低氧处理；营养液添加TFP抑制了ADH和LDH同工酶丰度和酶活性,ADH和LDH同工酶丰度和酶活性显著低于低氧处理,黄瓜幼苗植株生长受到抑制,黄瓜植株的低氧耐性降低。说明外源Ca2+参与了低氧胁迫下黄瓜根系无氧呼吸代谢的调节,增强了Ca2+向植物体内的运输,缓解了低氧胁迫对黄瓜幼苗植株的伤害,增强了植物对低氧的耐性。
　　 短期根际低氧胁迫下黄瓜根尖 Adh基因表达显著上调,营养液增施4 mmol·L-1 CaCl2显著增强了Adh基因的表达,而营养液添加钙离子通道抑制剂La3+抑制了Adh基因表达；根际低氧胁迫下,黄瓜根尖Mdh基因表达表现出先升高后降低,外源增施钙显著增加了胁迫初期(3h)Mdh基因表达,营养液添加La3+抑制了Mdh基因表达；根际低氧胁迫下,常钙低氧处理在胁迫初期Acs基因显著低于对照,而在胁迫6h后表达量与对照差异不显著,外源钙增强了黄瓜根尖Acs基因表达,处理期间Acs基因表达显著高于常钙低氧处理,营养液添加La3+抑制了胁迫后期Acs基因表达。表明钙在根际低氧胁迫下调节黄瓜植株呼吸代谢和通气组织形成发挥着重要作用,外源钙增强了黄瓜植株低氧胁迫初期的有氧呼吸,为细胞提供了能量,乙醇发酵途径缓解了低氧胁迫造成的能量危机；Acs活性升高,乙烯含量增加,有利于根系通气组织的形成,进而改善了低氧胁迫下黄瓜根系的微环境,从而增强了黄瓜植株的低氧耐性。
　　 低氧常钙处理幼苗体内K+、Ca2+、Mg2+含量显著降低,质膜、液泡膜、内质网膜ATPase活性显著降低；营养液增施Ca2+显著提高了植株体内K+、Ca2+、Mg2+含量和质膜、液泡膜、内质网膜 ATPase活性,接近或达到对照水平；低氧胁迫下营养液增施 Ca2+通道抑制剂La3+显著降低了黄瓜幼苗体内K+、Ca2+、Mg2+含量和质膜ATPase的活性,但对液泡膜和内质网膜ATPase活性影响不显著。表明,外源钙通过增加植株矿质营养离子的吸收和转运,维持质膜和内膜ATPase活性,从而缓解低氧胁迫对植株造成的伤害,增强黄瓜幼苗植株的低氧耐性。
　　 低氧处理48h后超过1000个蛋白点经过双向电泳和考马斯亮蓝染色方法成功分离,10个蛋白点在低氧胁迫下显著上调,外源钙处理中部分或全部得到恢复；34个蛋白点低氧胁迫下显著下调,外源钙处理中部分或全部得到恢复。33个蛋白点质谱鉴定表明,这些蛋白涉及蛋白质合成与修饰、活性氧代谢、细胞壁组分的生物合成、碳代谢,还有一些未知蛋白。低氧胁迫下,黄瓜根尖蛋白质的合成受到抑制,蛋白点减少；营养液添加钙缓解了根系蛋白质合成的受阻,蛋白点增加,同时,与蛋白质合成、活性氧代谢、细胞壁合成和碳代谢相关的蛋白点的丰度显著上调,有利于植株体内活性氧的清除和根系通气组织的形成,使植株根系内微环境得到改善,从而提高了黄瓜植株的低氧耐性。