甲胺磷降解菌株的分离鉴定、降解特性及菌株MAP-1的应用研究

摘要

甲胺磷是一种剧毒有机磷类杀虫剂,虽已遭到禁用,但由于其高效、广谱的杀虫效果以及低廉的价格,有些地区仍在违规生产和使用。尽管甲胺磷在土壤、水体等环境中的半衰期较短,但由于甲胺磷的施用量高,甲胺磷带来的环境污染和食品安全问题引起了广泛重视并急需解决。因此,从污染环境中分离高效、稳定的甲胺磷降解菌株,并将其应用于甲胺磷等有机磷农药污染环境的修复具有重要的理论和现实意义。
　　 本研究从长期受有机磷农药污染的农药厂下水道污泥中分离获得三株甲胺磷降解菌株MAP-1、MAP-2和JW-64-1。经形态观察、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析,将MAP-1、MAP-2和JW-64-1分别鉴定为生丝微菌属(Hyphomicrobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)和黄色单胞菌科的Luteibacter属。本研究首次从上述三个属中分离获得甲胺磷降解菌株。
　　 菌株JW-64-1与黄色单胞菌科Luteibacter属中仅有的三个模式种L.rhizovicinusDSM16549T、L.yeojuensis DSM17673T及L.anthropi CCUG25036T的16S rRNA基因序列相似性最高,分别为98.6％、98.4％和98.2％,而与其它模式种的同源性均低于97.0％。菌株JW-64-1脂肪酸主要为iso-C17:1ω9c(24.2％)、iso-C15:0(23.0％)和iso-C17:0(20.0％),醌为Q-8,极性酯主要为双磷酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷氨基脂(PN)、胺脂质-1(AL-1)、胺脂质-2(AL-2)和磷脂(PL)。JW-64-1的基因组DNA G+C mol％含量为63.7±0.3％。菌株JW-64-1和L.rhizovicinus、L.yeojuensis的DNA-DNA杂交同源性分别为34.8％和25.6％。综合这些结果,我们将菌株JW-64-1鉴定为Luteibacter属中的一个新种,命名为Luteibacter jiangsuensis sp.nov.。
　　 菌株MAP-1和MAP-2降解甲胺磷的最适培养基为MSM-3(5 mL CH3OH,1.0 gNH4NO3,1.5 g K2HPO4·H2O,0.5 g KH2PO4,0.5 g NaCl,0.2 g MgSO4·7H2O,水1,000mL,pH7.0-7.2)。菌株JW-64-1降解甲胺磷的最适培养基为MSM-1(1.0 g NH4NO3,1.5 gK2HPO4·H2O,0.5 g KH2PO4,0.5 g NaCl,0.2 g MgSO4·7H2O,水1,000mL,pH7.0—7.2)。菌株MAP-1能利用甲胺磷为唯一碳、氮或磷源生长和降解,完全去除3,000 mg·L-1甲胺磷只需84 h,是已发现的对高浓度(>1,000 mg·L-1)甲胺磷降解能力最强的微生物。菌株MAP-2和JW-64-1能利用甲胺磷为碳源生长和降解,96 h以内将1000 mg·L-1甲胺磷分别降解69.7％和49.5％。三株菌生长和甲胺磷降解的适温范围都为25～30℃,适宜的pH值为6.0～8.0。通气条件不好对菌株MAP-2生长和降解甲胺磷的影响远远大于对菌株MAP-1和JW-64-1的影响。添加1 mmol·L-1Ca2+对菌株MAP-1、MAP-2和JW-64-1降解甲胺磷有明显促进作用,但菌株MAP-1降解甲胺磷受1 mmol·L-1的Cu2+、Co2+和Ni2+抑制,菌株MAP-2受1 mmol·L-1 Cu2+抑制,菌株JW-64-1受1mmol·L-1Cu2+和Mn2+抑制。添加0.5％蛋白胨或酵母粉对菌株MAP-1生长和降解甲胺磷具有促进作用。和其它两株菌相比,MAP-1有比较广的有机磷农药降解谱,5 d对500 mg·L-1乙酰甲胺磷、100 mg·L-1水胺硫磷、甲基异柳磷和苯线磷的降解率分别为100％、73.5％、48.3％和32.5％。菌株MAP-2在5 d内能完全降解200 mg·L-1乙酰甲胺磷,去除58.4％100 mg·L-1乐果和40.6％100 mg·L-1敌敌畏。菌株JW-64-1降解谱最窄,除甲胺磷外只能降解乙酰甲胺磷,5 d内降解85.3％1000 mg·L-1乙酰甲胺磷。
　　 提取了降解菌株MAP-1的粗酶,研究发现甲胺磷降解酶属于组成型表达酶,主要存在于细胞外膜。菌株MAP-1甲胺磷降解酶最适反应pH值7.0、温度30℃,在总体积5 mL体系中,粗酶液最适添加量80μL、反应时间10 min。Ca2+对粗酶活性有促进作用,Cu2+和Co2+、表面活性剂Triton X-100和SDS、有机溶剂乙酸乙酯、二氯甲烷和三氯甲烷对酶活性有显著抑制作用。
　　 采用MS/MS和GC—MS两种质谱技术检测到菌株MAP-1降解甲胺磷存在三种降解产物:单硫代磷酸二甲酯、硫代磷酸单甲酯和磷酸单甲酯,并由这三种降解产物推测出菌株,MAP-1降解甲胺磷的可能途径。第一步,P-N键的断裂产生单硫代磷酸二甲酯和NH3；第二步,单硫代磷酸二甲酯的P-O键被水解释放CH3O-形成硫代磷酸单甲酯,单硫代磷酸二甲酯也能水解P-S键释放CH3S-形成磷酸单甲酯；第三步,硫代磷酸单甲酯或磷酸单甲酯继续发生P-O键或P-S键的水解释放出CH3O-或CH3S-,转化为无机磷酸盐PO43-。
　　 马肝土中接种107/克干土的降解菌株,9 d内可将1,000 mg·kg-1甲胺磷、500 mg·kg-1乙酰甲胺磷降至检测不出,15d内对100 mg·kg-1水胺硫磷降解率达40.0％(灭菌土壤)。当马肝土菌株MAP—1接种量加大或向土壤添加甲醇可以促进这三种农药的降解。土壤是否处于淹水状态不会显著影响菌株MAP-1对土壤有机磷农药的降解。菌株MAP-1对土壤中50、10和1 mg·kg-1的甲胺磷、乙酰甲胺磷降解也很显著,不存在低浓度降解率下降或不降解现象；菌株MAP-1对土壤中低浓度水胺硫磷的降解效率随浓度降低提升较快,当水胺硫磷浓度为1 mg·kg-1时降解率达94.6％。小青菜叶面喷施MAP-1菌液,使用菌数达5×1011 cell·m-2,可在7 d的安全间隔期内将3倍常规使用量的甲胺磷、1倍常规使用量乙酰甲胺磷和3倍常规使用量的水胺硫磷残留降至检测水平之下。