伏马菌素B1和黄曲霉毒素B1联合诱导Vero细胞凋亡的研究

摘要

伏马菌素是由串珠镰刀菌产生的一种水溶性的霉菌毒素,其中FB1是伏马菌素的主要组成部分,同时也是导致伏马菌素毒性的主要原因。FB1广泛存在于玉米及其制品中,对人类的健康以及畜牧业的发展构成了潜在的威胁。在体内、体外的研究中,FB1的毒性作用已经得以证实,包括肝、肾毒性,肺水肿,神经毒性,免疫抑制,以及致癌性等。研究表明FB1也具有较强的细胞毒性,但是目前关于FB1对细胞毒性研究的报道比较少,诱导细胞凋亡具体的信号转导机制的报道也不多。同时AFB1是由黄曲霉菌与寄生曲霉菌产生的一类次级代谢产物,也是目前已知的毒性最强的毒素,广泛存在于各种谷物和饲料中,而且还有致突变作用和致DNA损伤的作用,AFB1还能够引起诱发性肝癌,使肝脏广泛出血、坏死,对肾脏也有明显的损坏作用。鉴于两种毒素都广泛存在于各种谷物及其制品中,并且都能够产生肾毒性,所以本试验以FB1敏感细胞Vero细胞作为研究对象,经FB1和AFB1的单独和联合作用后,观察对Vero细胞的形态学、细胞的活性、线粒体膜电位以及凋亡时相关蛋白表达的变化的影响,探讨两种毒素诱导细胞凋亡的作用机制以及两者的联合作用,为深入研究FB1的毒性机理以及FB1诱导细胞凋亡的机制奠定了基础。
　　 试验一:
　　 本试验将处于对数期生长的Vero细胞以不同浓度的FB1和AFB1,以及两者的联合浓度进行处理,并设置空白培养基作为对照组。24 h后,采用MTT法测定各浓度组毒素对Vero细胞的毒性作用；于倒置显微镜下观察Vero细胞在形态学上的变化；用琼脂糖凝胶电泳来检测其DNA的完整性。结果显示:MTT法测定毒素对Vero细胞的增殖抑制率中,在作用时间相同的情况下,FB1和AFB1两种毒素单独作用时,随着毒素浓度的加大,细胞的增值抑制率也逐渐增大；当FB1分别与AFB1的两个浓度联合时,FB1的细胞增殖抑制率比单独时的抑制率都高,其IC50也显著的降低。形态学上的变化显示,FB1从2500 ng·mL-1开始对Vero细胞产生较明显的凋亡作用,AFB115、30 ng·mL-1两个浓度对Vero细胞都具有诱导凋亡的作用,其中各浓度毒素组细胞的凋亡率都是显著高于对照组的；琼脂糖凝胶电泳后,各试验组的细胞均形成DNA ladder,证明细胞的DNA发生了断裂,引起了细胞的凋亡。
　　 试验二:
　　 本试验将处于对数期生长的Vero细胞以不同浓度的FB1和AFB1,以及两者的联合浓度进行处理,并设置空白培养基作为对照组。24h后,经JC-1染色后,用流式细胞仪来检测线粒体膜电位的变化情况。结果显示:线粒体膜电位的检测中,在作用时间相同的情况下,FB1单独时,从浓度2500 ng·mL-1开始与对照组相比差异显著,并且随着FB1浓度的逐渐增大,线粒体膜电位的下降程度也越来越明显,15 ng·mL-1 AFB1低浓度联合组以及30 ng·mL-1 AFB1高浓度联合组中线粒体膜电位的下降程度都比FB1单独时下降的大。
　　 试验三:
　　 本部分试验采用免疫蛋白印迹(Western Blotting)检测FB1和AFB1单独和联合作用时凋亡相关蛋白caspase-3表达量的变化。结果显示:caspase-3蛋白的分子量为35 KD,经SDS-PAGE电泳、转印后,毒素处理组和正常对照组均在相应的位置出现了阳性的棕色条带,FB1单独组中,定量结果显示,随着毒素浓度的增加,caspase-3蛋白也相应的增加；当FB1分别与15、30 ng·mL-1 AFB1联合作用于Vero细胞时,产生的caspase-3蛋白与单独作用时相比,蛋白量有明显的增加。