抗赤霉病和抗蚜虫小麦转基因载体构建与非抗生素标记筛选方法的研究

摘要

小麦(Triticun aestivum L)是世界上最重要的粮食作物之一,一直以来,由于不良气候、病虫害等因素严重影响小麦的高产稳产。近几年,基因工程技术的发展和完善,为小麦品质改良提供了一条新的途径,在解决世界粮食问题中起重要作用。小麦转基因研究涉及抗病、抗虫、抗逆、提高产量、品质改良等方面,其中研究较多的为品质改良(25.6％)和抗病(39.7％),部分转基因小麦品系已投入生产性试验。在植物转基因上应用的筛选体系一般可分为正向筛选体系和负向筛选体系,通常我们感兴趣的转基因植物中含有带有抗生素或抗除草剂的筛选标记基因,这些属于负向筛选体系,然而由于这些选择标记基因的存在引发了食品和环境的生物安全问题。此外,标记基因的危险评价过程耗时耗财,而且这些基因的产物在转基因植物中的释放需要一定的时间.因此比在安全性方面具有优势的正向筛选体系近年来得到迅速发展,现在常用的正向筛选体系有GUS筛选体系、绿色荧光蛋白基因(GFP)筛选体系、木糖筛选体系、PMI基因/甘露糖筛选体系等。
　　 小麦赤霉病和麦蚜属于小麦上的顽症、顽虫。赤霉病(scab=Fusarium head blight)是由镰刀菌(Fusarium spp)引起的一种世界性麦类病害,本实验室参与的国家转基因重大专项以有效兼治小麦重要病害与虫害为目标,利用在植物防卫与生长信号传导的启动与调控关键环节上起决定性作用的基因,使用我们实验室现有的基因及相关材料与研究体系,利用转基因技术,结合植物培养与再生以及温室加代繁殖等常规育种方法,培育抗赤霉病、并抗蚜虫的转基因小麦种质,为品种化提供基础。本论文研究选用对植物抗病虫防卫与生长发育有正向交叉调控作用的基因,提高转基因小麦的抗病虫水平和持久性,兼顾麦粒产量与品质。同时,利用受植物生长发育调控以及病菌和麦蚜诱导的启动子,构建不同转基因单元,保证转基因小麦能在适当的时候、或在受麦蚜侵袭或赤霉病菌侵染时表达目的基因,达到适时、有效抗病虫的效果。本论文对小麦转基因的方法和筛选体系进行了初步探索,以小麦品种扬麦158的幼胚为外植体,研究了不同甘露糖浓度对幼胚外植体愈伤组织诱导和生长的影响。以小麦幼胚为外植体的磷酸甘露糖异构酶(PMI)/甘露糖筛选中,可以10 g/L甘露糖作筛选压。另外,在培养早期阶段筛选比较适宜。以大肠杆菌(Escherichia coli)6-磷酸甘露糖异构酶(6-phosphomannoseisomerase,PMI(Man A))基因替换植物表达载体pCAMBIA1300中的潮霉素(Hygromycin Hyg)基因,构建了以PMI基因为选择标记基因的植物表达载体pCAMBIA1300::PMI::gene::Nos,并导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中。研究了表达载体对小麦幼胚形成的愈伤组织的转化,在培养基附加15g/L甘露糖和10g/L蔗糖为碳源的选择压力下,pCAMBIA1300::PMI的转化率较为理想,对再生植株用氯酚红和PCR检测初步证实了PMI基因的导入,建立了以PMI/甘露糖为选择系统的小麦转基因体系。