酸黄瓜(Cucumis hystrix Chakr.)抗南方根结线虫(Meloidogyne incognita)相关机理与抗病渐渗系鉴定

摘要

南方根结线虫（Meloidogyne incognita）是危害黄瓜（Cucumis sativusL．，2n=2x=14）生产的重要病原．栽培黄瓜种内南方根结线虫病抗源匮乏，致使黄瓜南方根结线虫病抗性育种滞后．通过种间杂交将野生种中的抗线虫性状引入栽培黄瓜是黄瓜抗线虫育种取得重要突破的有效途径。甜瓜属野生种酸黄瓜（Cucumis hystrix Chakr.，2n=2x=24）与栽培黄瓜已成功实现杂交，对其杂种染色体加倍后获得双二倍体新种（Cucumishytivus Chen and Kirkbdde，2n=4x=38），该种间杂种是进行黄瓜遗传改良的重要基因资源．全文从发掘和利用黄瓜南方根结线虫病抗性基因资源出发，以酸黄瓜、栽培黄瓜以及酸黄瓜与栽培黄瓜种间杂交后代为研究材料，研究酸黄瓜的南方根结线虫病抗性特点及其遗传转移，探讨其抗性形成的内在机制，在种间杂交基础上，筛选抗南方根结线虫病的黄瓜-酸黄瓜渐渗系，分析其在抗性基因定位与黄瓜遗传改良中的利用价值．主要研究内容及结果如下：
　　 1．黄瓜根结线虫病原鉴定与抗病种质资源筛选：
　　 对供试的3个根结线虫样本进行了形态学观测和同工酶分析，结果表明其雌虫会阴花纹形态与南方根结线虫（Meloidogyne incognita）和爪哇根结线虫（M.javanica）相似，苹果酸脱氢酶(MDH)和酯酶(EST)表型与南方根结线虫相同，确定供试线虫样本为南方根结线虫．根结线虫适宜寄主筛选结果表明，粉果番茄品种‘苏粉3号’繁殖南方根结线虫效果优于红果番茄‘农大508’，夏秋季繁殖效果好于冬春季，培养时间以45d~55d为宜，4℃离体保存选择在4d以内．
　　 采用温室盆栽苗期人工接种鉴定技术，对14份甜瓜属（Cucumis）种质资源进行了南方根结线虫抗病性鉴定．通过聚类和方差分析，将供试材料分为高感、中感、感病和高抗4类，2份野生种质对南方根结线虫表现高度抗性，甜瓜属其它栽培种为感病类型．酸黄瓜与栽培黄瓜种间杂交后代材料均为抗病类型，表明酸黄瓜的南方根结线虫病抗性已通过种间杂交部分转移至后代中．
　　 2．酸黄瓜南方根结线虫病抗性的形成机制：
　　 为探明酸黄瓜南方根结线虫病抗性的解剖学及其细胞学机理，对线虫侵入与幼虫发育、根的解剖学及线虫诱导形成的取食位点的细胞学结构进行了研究．结果表明，抗病材料酸黄瓜根系中线虫侵入率极显著低于感病材料北京截头(P<0.01)，酸黄瓜能够有效抵抗南方根结线虫的侵入；抗、感材料根系中雌雄虫个体比例分别为1：12和1:5（P<0.01），抗性反应能够抑制线虫取食和幼虫发育；抗病反应中细胞发生过敏性坏死，感病反应中无此类现象发生。抗侵入、抑制取食和坏死反应是抗病材料酸黄瓜抗性反应的主要特征。
　　 采用高效液相色谱（HPLC）分析法，研究了南方根结线虫病抗性与葫芦素B含量的关系．供试材料根系中的葫芦素B含量以酸黄瓜的最高(1.31μg/g)，非洲角次之(0.85μg/g)，北京截头最低(0.35μg/g)，表明酸黄瓜中葫芦素B的本体含量较高．酸黄瓜、非洲角、北京截头受线虫侵染后根系中的葫芦素B含量较相应未接种对照分别升高了198％、214%和40%，表明酸黄瓜经线虫诱导后葫芦素B含量上升较大，酸黄瓜受线虫危害低于非洲角并显著低于北京截头，说明酸黄瓜的抗线虫能力较强．供试材料受害程度与葫芦素B含量相关性分析表明，作物的抗线虫能力与根系中的葫芦素B含量呈正相关关系，其含量越高，抗性越强，酸黄瓜的高葫芦素B含量是其南方根结线虫病抗性的化学证据．
　　 以抗感甜瓜属种质为试材，研究了线虫侵染对根系争叶片活性氧(ROS)代谢、防御酶活性及相关抗性指标的影响。结果表明，抗病材料酸黄瓜中超氧阴离子（02-）和过氧化氢(H202)含量受线虫侵染增加的幅度显著小于感病材料北京截头，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性变化率与其病情指数分别呈显著正相关(r=0.8278*)、极显著负相关(r=-0.9679**)和显著负相关（r=-0.8499*），线虫侵染后酸黄瓜根系中增加了3条POD同工酶谱带(Rf=0.126，0.188，0.944)，而北京截头只增加了1条弱带（Rf=0.396），线虫侵染导致电导率(EL)上升和丙二醛(MDA)含量增加幅度北京截头高于酸黄瓜，根系活力下降幅度酸黄瓜显著小于北京截头．酸黄瓜受线虫侵染氧化胁迫较小，根系活力较高，从而使酸黄瓜对线虫侵染表现出了较好的耐性，
　　 为解析酸黄瓜南方根结线虫病抗性的光合响应机制，研究了线虫侵染对黄瓜叶片光合作用、叶绿素荧光参数及相关生理指标的影响．线虫侵染使酸黄瓜叶片叶绿素(Chl)含量降低幅度显著小于‘北京截头’，酸黄瓜Chl随氮(N)素含量降低较‘北京截头’平缓；线虫侵染导致二者净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)下降，酸黄瓜胞间C02浓度(Ci)下降，而北京截头接种14d后Ci急剧上升，酸黄瓜Gs对叶片相对含水量（RWC）下降的反应较北京截头敏感；实际光化学效率(φPSⅡ)，光化学猝灭系数(qP)降低幅度酸黄瓜小于北京截头，非光化学猝灭系数(qN)升高幅度酸黄瓜显著高于北京截头；线虫侵染对酸黄瓜Pn/Ci初始斜率影响不大，而使北京截头急剧降低．研究结果说明，酸黄瓜具有相对较高的养分及水分利用率，叶绿素含量下降较小，能够较多地将光能用于光化学反应，热耗散能力较强，从而保持了较高的净光合速率，使得线虫侵染对酸黄瓜植株生长造成的影响不大．
　　 3．抗南方根结线虫病黄瓜、酸黄瓜渐渗系的筛选鉴定
　　 通过对黄瓜-酸黄瓜种间杂交后代群体进行抗线虫鉴定、形态学观测和分子生物学鉴定，筛选出抗南方根结线虫病黄瓜．酸黄瓜渐渗系ILs-10-1．渐渗系ILs-10-1抗南方根结线虫，其抗性表现稳定；田间农艺性状和形态学观测发现，其具有小叶、短果、棕色瘤剌、多分枝的特点，且与栽培黄瓜杂交亲和；利用SSR分子标记分析发现，SSR18648能够在渐渗系ILs-10-1中稳定重复地扩增出野生亲本酸黄瓜的特异DNA片段，从分子水平上证实了渐渗系ILs-10-1为酸黄瓜与栽培黄瓜发生渐渗杂交的种间杂交后代．