中国东部PCV2分子流行病学与PCVD亚单位疫苗抗原分子研究

摘要

猪圆环病毒病(PCVD)是猪圆环病毒2型(PCV2)引起的又一种新的重要传染病，主要临床表现包括：断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征( PDNS)、猪呼吸道复合体病和繁殖障碍等。其中，PMWS对全球养猪业影响巨大，主要发生于5-12周龄猪，发病猪主要表现为衰竭、淋巴结肿大、呼吸困难、贫血、腹泻，黄疸和皮肤苍白，并出现免疫抑制，易发生多病原混合感染，加剧临床症状。
　　 PCV2是圆环病毒科圆环病毒属的重要成员，无囊膜。基因组为单股环状DNA，全长1767或1768nt，含3个主要阅读框：ORF1、ORF2和ORF3．ORF1编码病毒复制相关蛋白；ORF2编码病毒衣壳蛋白——Cap蛋白，包含多个线性B细胞表位和中和表位，能够诱导保护性免疫反应；ORF3编码的蛋白与病毒诱导的细胞凋亡有关。PCV2可以分为2个大的基因型：PCV2a和PCV2b。PCV2a包括2A-2E五个亚型；PCV2b包含1A、1B、1C亚型。很多国家地区都已发现优势基因型的飘移，且认为PCV2b比PCV2a毒力更强。
　　 疫苗免疫是预防PCVD的有效手段。国内外商品化疫苗主要有灭活疫苗、杆状病毒Cap蛋白重组亚单位疫苗和PCV1-PCV2嵌合病毒灭活疫苗。本研究对我国东部31株PCV2全基因序列进行了分析，明确了PCV2分子流行病学特征；利用大肠杆菌表达系统分析了Cap蛋白不同截断表达产物的抗原特性；构建了融合表达Cap蛋白和生长抑素的重组大肠杆菌和杆状病毒，并分别进行了免疫特性测定，为PCV2基因工程疫苗研究奠定了基础。本研究具体内容如下：
　　 1．中国东部PCV2分子流行病学调查通过临床病料的检测，PMWS的确诊，病毒分离，扩增获得2001-2009年间从中国东部11个省份发病猪场分离到的31株PCV2全基因序列，将其与已公布的另105株中国东部分离株的序列进行比对和进化分析．结果表明这些毒株分属PCV2b和PCV2a两个型，其中PCV2b中有108株属1A/1B亚型，19株属1C亚型；PCV2a中有1株属2A亚型，2株属2D亚型，6株属2E亚型。在9个PCV2a型毒株中，有8个分离自2005年之前。此外，氨基酸序列分析发现：在Cap蛋白的53-91、121-151和190-210位氨基酸存在三个高度变异区；每种亚型具有某些特有的氨基酸变异模式；Cap蛋白上存在一些变异的或保守的抗原表位；同时在自然条件下存在不同基因型间的重组。以上研究结果说明在2001-2009年中国东部地区PCV2流行毒株存在PCV2a和PCV2b两个基因型，同时存在由PCV2a向PCV2b的漂移现象，这为中国猪圆环病毒病的防控提供了依据。
　　 2．猪圆环病毒2型Cap蛋白截断表达及其抗原特性研究分别扩增五段不同长度的Cap蛋白基因克隆入原核表达载体并转化大肠杆菌BL21，经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白得到成功表达（Cap-A:51-150aa、Cap-B:51-200aa、Cap-C:51-234aa、Cap-D:101-200aa、Cap-E:101-234aa）。系统的研究不同大小的Cap蛋白亚单位在抗原性方面的差异：将纯化的5个重组蛋白分别包被酶标板，利用14份IFA阴性血清和10份IFA阳性血清进行ELISA试验，结果为第51-234aa片段(Cap-C)抗原包被组S/N值高于其它4个片段抗原组。将5个重组蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠，检测其抗体产生动态，发现Cap-C组诱导的抗体水平最高，而Cap-D诱导的反应最弱。本研究结果表明，Cap-C抗原反应原性和免疫原性高于其它重组截断蛋白，为PCV2 ELISA抗体检测方法和亚单位疫苗研制奠定了重要基础。
　　 3．猪圆环病毒2型Cap蛋白原核表达重组亚单位疫苗免疫保护效力研究在筛选获得大肠杆菌表达产物Cap-C蛋白具有较好免疫原性基础上，采用ISA206和CP940等4种佐剂配制疫苗，小鼠免疫试验结果表明，与不加佐剂抗原对照组相比，4种佐剂均可有效提高Cap重组蛋白诱导的ELISA抗体水平（P>0.05）。采用CP940水佐剂Cap重组亚单位疫苗PCV2灭活疫苗进行猪体免疫保护试验，结果为：该疫苗经两次免疫可诱导猪体产生较高的ELISA抗体；攻毒后Cap-C免疫组猪和灭活疫苗免疫组猪仅出现短时间的发热，无明显临床症状，相对日增重与空白对照相似（P>0.05），但明显高于攻毒对照组(P<0．05)。两免疫组在病毒血症、淋巴结病毒载量、病理学变化方面相似，但明显轻于攻毒对照组。该研究结果表明，大肠杆菌表达的Cap重组亚单位疫苗对PCV2感染具有较好免疫保护作用，有望成为防控PCV2所致相关疾病的新型候选疫苗。
　　 4．表达猪圆环病毒2型Cap-生长抑素融合蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定VLPs疫苗是一类新的亚单位疫苗，具有全病毒的结构又不合核酸，更加安全有效，而且它可以作为外源抗原片段或表位的载体，构建嵌合疫苗。杆状病毒表达系统是生产VLPs的常用工具，已有报道经此系统表达的PCV2 Cap蛋白可以形成VLPs;生长抑素(SS)是十四个氨基酸的小肽，与下丘脑生长激素释放因子( GHRF)共同调节生长激素(GH)的释放，研究表明通过与载体蛋白融合表达，主动免疫动物，可使机体产生针对SS抗体，中和体内SS，解除SS的抑制作用，促进动物的生长。本研究通过PCR的方法扩增得到PCV20 RF2基因和在其末端引入SS基因的ORF2-SS基因片段，将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统pFastBacTM HT B载体中，经PCR、酶切、测序鉴定筛选获得的阳性重组质粒pF-Cap和pF-Cap-SS，转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态大肠杆菌中，经蓝白菌落筛选和PCR鉴定，获得重组表达载体rBac-Cap和rBac-Cap-SS。在脂质体介导下转染对数生长期的Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒rAt-Cap和rAc-Cap-SS，将重组病毒传代扩增。间接免疫荧光和Western-blot实验结果表明，目的蛋白BCap和BCap-SS得到正确表达，表达的蛋白具有良好的反应原性；将目的蛋白超离纯化，电镜观察可以形成病毒样颗粒(VLPs)．将病毒传代增殖，空斑试验检测重组病毒滴度可达5×107pfu/mL.
　　 5．杆状病毒系统表达的PCV2 Cap-生长抑素融合重组蛋白亚单位疫苗免疫特性研究将杆状病毒表达获得的重组Cap-SS蛋白(BCap-SS)制备疫苗，评价其免疫效果和对动物体增重的影响。小鼠试验结果为：BCap-SS和BCap两种重组蛋白均可诱导产生PCV2特异抗体，两次免疫后ELISA抗体效价可达1:1600，BCap-SS免疫组小鼠增重高于BCap和空白组。猪体试验结果为：两次免疫后可诱导猪体产生较高水平的PCV2特异ELISA抗体(1:1024)；首免后2周和4周，BCap-SS免疫组猪相对日增重(RDWG)明显高于其余各组，2周时血清SS浓度明显降低，显示出较好的促增重效果。免疫猪攻毒后，BCap-SS与其它疫苗免疫组仅出现短时间的发热，每组只有1-2头猪表现出精神稍差，而攻毒对照组所有猪发热时间较长，精神沉郁。攻毒后的25天内攻毒对照组RDWG明显低于其他各组。此外，疫苗免疫组在病毒血症、淋巴结病毒载量、病理学变化方面相似，明显轻于攻毒对照组。这表明杆状病毒表达的BCap-SS有望成为即可预防PCVD又可改善生产性能的新型疫苗。
　　 6．大肠杆菌系统表达PCV2 Cap-生长抑素融合蛋白重组体构建与免疫特性研究将生长抑素SS基因引入Cap-C编码基因的末端，克隆入原核表达载体pET-32a(+)，在大肠杆菌中表达，SDS-PAGE结果表明重组蛋白获得表达，经包涵体洗涤纯化复性后可得到较高纯度的重组蛋白，将纯化的重组蛋白Cap-SS制备疫苗，以Cap-C作为对照进行猪体攻毒保护试验，评价其免疫效果和对动物体增重的影响，结果为：两次免疫后可诱导猪体产生较高水平的特异抗体，首免后4周时，Cap-SS免疫组猪相对日增重（RDWG）明显高于其余各组，血清SS水平在2周时显著低于其余各组，显示器其具有较好促增重效果。攻毒后，免疫组仅出现短时间的发热，没有明显临床症状。攻毒后的25天内攻毒对照组RDWG明显低于其他各组。此外，免疫组在病毒血症、淋巴结病毒载量、病理学变化方面相似，明显轻于攻毒对照组，证明大肠杆菌系统表达PCV2 Cap-生长抑素融合蛋白亚单位疫苗具有较好免疫保护作用和促生长作用。
　　 综上所述，本研究证实了我国东部2001-2009年PCV2流行毒株有PCV2a和PCV2b两个基因型，主要为PCV2b，丰富了我国PCV2分子流行病学资料。同时证实大肠杆菌表达的Cap蛋白第51-234aa片段具有很好的反应原性和免疫原性，并可诱导仔猪产生免疫保护反应。杆状病毒和大肠杆菌表达的Cap-SS融合蛋白既可诱导猪体产生免疫保护反应，又可促进仔猪生长，从而为PCV2亚单位疫苗开发奠定了重要基础。