捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA疫苗的免疫保护作用与烯醇化酶特性的研究

摘要

捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）属毛圆科（Trichostrongylidae）血矛属（Haemonchus）线虫，分布较广，寄生于反刍动物第四胃，偶见于小肠，因吸血常常导致贫血、消瘦、严重时甚至死亡，对畜牧业造成重大经济损失．目前防治该病方法主要是化学药物驱虫，但由于虫体抗药性的产生以及药物残留和药物污染等问题，迫使人们将注意力转移到利用免疫学方法来防治该病．
　　 本文进行了捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，HcGAPDH）特性研究及其疫苗免疫保护试验；同时对捻转血矛线虫烯醇化酶（Enolase，HcENO）进行了生物学特性研究，克隆得到捻转血矛线虫磷酸甘油酸激酶基因序列并对其进行了生物信息学分析，主要工作如下：1．捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶特性的研究
　　 根据GenBank上登录的捻转血矛线虫甘油醛3磷酸脱氢酶基因EST序列（登录号为AW670737，登录长度为362bp）设计基因特异性引物，分别利用5'RACE和3'RACE获得该基因5，端未知区和3，端未知区，从而拼接得到HcGAPDH基因的全长eDNA，然后将该序列递交GenBank（登录号为HM145749）．后经分析发现：该基因全长1303bp，含有最大开放阅读框(ORF)为1026bp，5’非翻译区(5’-UTR)长90 bp，3啡翻译区（3'-UTR）长175bp．根据此基因的全长cDNA设计l对特异性引物，以捻转血矛线虫的总RNA为模板，利用RT-PCR技术，扩增出约1000bp的产物，测序结果与推导出的ORF序列一致．BLAST分析后将该片段克隆到pET-28a(+)载体中，转化入感受态大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白．SDS-PAGE结果分析发现融合蛋白在上清和包涵体中均有表达，分子量约38kDa．以自然感染的山羊血清作为一抗，Western blot分析结果显示在38kDa处出现特异性条带．用HcGAPDH表达蛋白的包涵体免疫大鼠制备高免血清做一抗，Western blot分析HcGAPDH基因在捻转血矛线虫的天然表达，结果在38kD处有明显条带，与推测ORF的蛋白大小无明显区别．酶活性测定结果表明该重组蛋白具有一定的甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化活性，其最适pH值为8，最适反应温度为40℃．
　　 2.捻转血矛线虫甘油醛-3-酸脱氢酶虫体组织分布的研究
　　 为了研究捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyeeraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，HcGAPDH)在虫体中的分布与定位情况，我们应用常规方法表达已构建好的pET28a-HcGAPDH，GE纯化柱纯化后，免疫SD大鼠制备抗血清．浓缩型S-P免疫组化3步法检测HcGAPDH抗原在捻转血矛线虫体内的分布和表达．结果发现，HcGAPDH主要定位于小肠微绒毛上皮，在其他部位则鲜见．
　　 3.捻转血矛线虫pVAXI-HcGAPDH DNA疫苗的构建与体内表达情况的检测
　　 利用DNA重组技术，构建pVAXl-HcGAPDH DNA疫苗．经酶切鉴定后，腿部肌肉免疫小鼠，l周后取肌肉注射部位、非注射部位组织，利用RT-PCR和Western-blot技术分别检测DNA疫苗的转录与表达情况．RT-PCR检测结果显示，小鼠注射部位肌肉所扩增出的目的条带大小约为1000bp，非注射部位中未能检测到目的条带，从而说明重组质粒在注射部位可以成功转录；Western blot检测结果发现，在注射部位检测到大小为38kD的目的蛋白条带，而非注射部位未能检测到目的蛋白的条带，这些结果都为下一步的动物保护性试验奠定了基础．
　　 4.捻转血矛线虫pVAXI-HcGAPDH DNA疫苗的免疫保护性试验
　　 使用DNA疫苗pVAXl-HcGAPDH，对9-10月龄山羊做了免疫保护性试验．健康山羊15只，随机分成3组，每组5只．一组免疫100μg pVAXI-HcGAPDH，其他两组为不攻虫对照组和攻虫对照组．在试验山羊的背部皮下多点注射免疫，两个对照组用lml PBS代替DNA疫苗，一共免疫两次，中间间隔2周，第二次免疫14天后，疫苗免疫组和攻虫对照组山羊口腔接种5000条捻转血矛线虫第三期感染性幼虫．从攻虫后22至34天，每隔一天收集粪便，虫卵计数，攻虫后35天，屠宰山羊并剖解皱胃，分离雌雄虫体，进行成虫计数，同时，采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法，测定了所有试验山羊血清特异性IgG滴度、血清以及胃粘膜表面和胃粘膜组织匀浆中特异性IgA浓度．在免疫前、首免后14d、二免后14d、攻虫后14d和杀羊前对以下指标进行检测：利用ELISA试剂盒检测血清细胞因子（IFN-γ、TGF-β、IL-4、IL-22）的浓度变化；利用流式细胞术检测了所有试验山羊外周血中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和B淋巴细胞的变化；利用全自动电子血细胞分析仪对所有试验山羊的外周血中嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和血红蛋白进行了检测，结果显示，DNA疫苗pVAXI-HcGAPDH免疫山羊后，ELISA检测结果表明血清IgG在首免后14天达到较高水平，二免后抗体水平进一步升高；血清IgA在免疫后出现较高水平的滴度，同时杀羊后发现胃粘膜组织匀浆具有较高的滴度，免疫后山羊CD4+T淋巴细胞、B淋巴细胞水平显著高于不攻虫对照组，同时细胞因子检测免疫组K,-4水平上升显著，IFN-γ、TGF-β、IL-22变化规律性不明显．分析试验山羊血细胞发现，免疫组和攻虫对照组山羊嗜酸性粒细胞浓度显著高于不攻虫对照组．5000条捻转血矛线虫三期幼虫攻击试验山羊后，免疫组虫卵减少率为34.9％，雌虫、雄虫和成虫总数减少率分别为39.23%，36.03%和37.73%，说明pVAXI-HcGAPDH对抵御山羊捻转血矛线虫的感染具有一定效果．
　　 5.捻转血矛线虫烯醇化酶特性的研究
　　 根据GenBank上登录的捻转血矛线虫烯醇化酶（Enolase）基因EST序列（登录号为BF422728，登录长度为482bp）设计基因特异性引物，分别利用5’RACE和3’RACE获得该基因5'端未知区和3’端未知区，从而拼接得到Enolase基因的全长cDNA．分析发现：该基因全长1583bp，含有最大开放阅读框（ORF）为1305bp，5’非翻译区(5'-UTR)长62 bp，3'啡翻译区(3’-UTR)长216bp．根据Enolase基因的全长cDNA设计l对特异性引物，以捻转血矛线虫的总RNA为模板，采用RT-PCR技术，扩增出约1300bp的产物，将该片段克隆到pET-28a(+)载体中，转化入感受态大肠杆菌BL21(DE3)进行表达．SDS-PAGE结果分析发现融合蛋白在上清和包涵体中均有表达，分子量约49kDa．以自然感染的山羊血清作为一抗，Western blot结果显示在49kDa处出现特异性条带．HcGAPDH表达蛋白的包涵体免疫大鼠制备高免血清做一抗，用Western blot分析HcGAPDH基因在捻转血矛线虫的天然表达，结果在49kDa处有明显条带，与推测ORF的蛋白大小近似．酶活性测定结果表明该重组蛋白具有一定的烯醇化酶催化活性，其最适pH值为7．
　　 6.捻转血矛线虫磷酸甘油酸激酶的生物信息学分析
　　 根据GenBank上登录的捻转血矛线虫磷酸甘油酸激酶(Phosphoglyccrate kinase,HcPGK)基因EST序列（登录号为CB192372，登录长度为584bp）设计基因特异性引物，分别利用5'ACE和3'ACE获得该基因5'端未知序列和3'端未知序列，从而拼接得到PGK基因的全长cDNA．利用生物信息学网站的各种在线分析工具，对其进行分析发现：该基因全长1584bp，最大开放阅读框（ORF）为1254 bp,5'非翻译区(5'-UTR)长95bp，3'悱翻译区（3'-UTR）长235bp．该基因编码417个氨基酸，相对分子量理论预测值为44，594 Da．存在多个潜在的生物活性功能位点，蛋白的理化性质稳定．有17个主要的B细胞抗原表位，这些为下步研究奠定了基础．