水稻细菌性条斑病菌群体感应调控的致病相关基因鉴定与功能分析

摘要

水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc）属黄单胞属（Xanthomonas）、水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）的一个致病变种，在水稻（Oryza sativa）上引起细菌性条斑病(bacterial leaf streak，BLS)，该病害严重威胁到热带和亚热带地区的水稻种植。依赖可扩散性信号分子（diffusible signal factor,DSF）的群体感应(quorum sensing，QS)系统是黄单胞属植物病原细菌生物学功能全局性调控网络的重要组成部分，在群体水平上调控病原菌的毒性因子表达、生物膜形成等重要生物学功能。大量成熟生物学研究技术手段（例如:核酸测序、蛋白质双向电泳、质谱分析、生物信息学等）的出现，使得高通量筛选和分析受群体感应系统调控的新颖致病相关基因变的可行。
　　本研究的目的是分析水稻细菌性条斑病菌中rpf(regulation of pathogenicity factors)基因簇的核心基因rpfF、rpfC和rpfG的生物学功能，利用蛋白质双向电泳技术分析DSF型群体感应系统对条斑病菌胞内蛋白质组和胞外蛋白质组表达的调控，鉴定受DSF型群体感应系统调控的新颖致病相关基因，分析这些基因的致病机制及怎样受到群体感应系统调控。
　　首先，为了明确水稻细菌性条斑病菌是否具有DSF型群体感应系统，本研究通过NCBI BLASTN分析发现黄单胞属病原菌中负责DSF信号分子合成、感应和转导的rpf基因簇是高度保守的。本研究证实rpfF基因的缺失导致水稻细菌性条斑病菌彻底丧失合成DSF信号分子的能力，rpfG基因的缺失导致DSF的合成能力显著下降，但是rpfC及fpC/rpfG的单双基因缺失突变均导致DSF超量合成。另外，rpfF、rpfC和rpfG基因的缺失突变均导致水稻细菌性条斑病菌的致病性丧失。在L液体培养基中静止培养时，野生型菌株Rs05没有形成明显的菌落聚集体，但是rpfF、rpfC、rpfG和rpfC/rpfG单双基因缺失突变均引起水稻细菌性条斑病菌细胞的聚集，形成不同形态的生物膜。这些结果表明，水稻细菌性条斑病菌的rpf基因簇负责群体感应信号分子DSF的合成，DSF型群体感应系统调控病原菌的致病性和群体形态的转化。
　　那么，DSF型群体感应系统通过调控哪些基因的表达来控制水稻细菌性条斑病菌的致病性是本论文关注的焦点。接着，本研究利用双向电泳技术比较分析了野生型菌株Rs105和rpfF缺失突变株（丧失合成DSF的能力）的胞内蛋白质组表达谱，结果发现48个蛋白质斑点的表达受到DSF调控（＞1.5倍）。利用质谱技术成功鉴定了其中的18个蛋白。利用NCBI和Pfam数据库对这18个蛋白进行功能预测，发现它们涉及多种生物学功能，例如氮源转换、蛋白质折叠、活性氧的消除、鞭毛的形成等。选取了其中6个蛋白对应的基因进行了缺失突变，发现编码RS27蛋白的基因Xoryp_010100018570(命名为hshB)是水稻细菌性条斑病菌保持致病性所必需的。
　　RS27是一个金属依赖活性的酰胺水解酶，N末端具有一段信号肽，它参与次生代谢产物的合成、转运和降解。通过NCBI BLASTN和Southern Blot分析证实hshB是黄单胞属细菌中相对保守的一个基因。RT-PCR分析证实了hshB和它的上游基因Xoryp_010100018565(命名为hshA)组成一个多顺反子。随后的试验结果表明hshB的缺失突变显著削弱了水稻细菌性条斑病菌的毒性、胞外蛋白酶活性、胞外多糖产量、在基本培养基中的生长能力和对氧化压力及噻枯唑的耐受性。clp编码一个全局性调控因子Clp(CRP-like protein)，本研究发现clp缺失突变体与hshB缺失突变体具有类似的表型。Real-time PCR分析发现DSF和clp联合正向调控hshB的转录，并且hshB的转录受到贫瘠营养条件的诱导。本研究不仅发现了一个受DSF型群体感应系统调控的新颖致病相关基因，并且从毒性因子的产生、生长适应性及克服氧迸发的角度揭示了水稻细菌性条斑病菌致病性丧失的原因。
　　另外，黄单胞属病原菌的毒性主要依靠其分泌到细胞外的各种毒性蛋白因子，并且这些毒性因子的表达和外泌受到DSF型群体感应系统的调控。本研究进一步完善了黄单胞菌胞外蛋白的提取和纯化方法，获得了水稻细菌性条斑病菌的高质量胞外总蛋白。然后利用双向凝胶电泳技术比较分析了水稻细菌性条斑病菌野生型菌株Rs105和rpfF缺失突变体（丧失合成DSF信号分子的能力）胞外蛋白表达谱，结果发现53个蛋白质的表达水平受到DSF调控(＞1.5)，利用质谱分析技术成功鉴定了50个蛋白质斑点。利用NCBI和Pfam数据库分析发现，其中47个蛋白质斑点对应于水稻细菌性条斑病菌BLS256菌株全基因组中的32个基因，它们涉及多种生物学功能，例如植物细胞壁降解酶、蛋白的转运、鞭毛的形成、活性氧的消除、信号转导、核酸代谢等。对其中9个蛋白对应的基因缺失突变，结果发现多聚半乳糖醛酸酶(B01)和丝氨酸蛋白酶(A03)对应基因的缺失分别显著削弱了水稻细菌性条斑病菌对水稻幼苗的毒力。利用SignalP3.0Server软件对鉴定的35个蛋白质的氨基酸序列进行在线分析，发现18个蛋白的N末端具有典型的信号肽，这个结果说明二型分泌系统是胞外蛋白的主要外泌途径。

目录

声明

摘要

上篇 文献综述

第一章 水稻细菌性条斑病菌的致病因子及与水稻互作的研究进展

1 黄单胞属病原菌的分类及危害

2 水稻细菌性条斑病菌的分类、生物学特性、分布及危害

3 水稻细菌性条斑病菌的毒性因子

4 水稻细菌性条斑病菌-水稻的互作研究进展

5 展望

第二章 黄单胞茵群体感应研究进展

1 主要的细菌群体感应类型

2 依赖AHLs的群体感应系统

3 依赖AI-2的群体感应系统

4 依赖DSF的群体感应系统

5 DSF家族信号分子参与种间信息交流

6 展望

下篇 研究内容

第一章 水稻细菌性条斑病菌rpf基因簇的功能分析

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第二章 水稻细菌性条斑病菌DSF型群体感应系统调控的胞内蛋白质组比较分析

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第三章 水稻细菌性条斑病菌中受群体感应调控的新颖致病相关基因hshB的鉴定和功能分析

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第四章 水稻细菌性条斑病菌群体感应调控的胞外蛋白质组比较分析

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

全文总结

本论文创新点

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表论文