质外体过氧化氢与水通道蛋白PIP1;4对Hpa1蛋白诱导拟南芥抗病性的调控作用

摘要

Harpin是由革兰氏阴性植物病原细菌产生的性质和功能相似的一类蛋白质，影响病原菌在寄主植物上的致病性和非寄主植物上的过敏反应(HR)。外施的harpin能诱导植物抗病、抗虫和抗旱，并且也能促进植物的生长。Harpin的这些多效性是由于激活了多种不同的信号通路，包括植物激素的转导、活性氧簇信号、离子通道、细胞程序性死亡、系统获得抗性(SAR)或水杨酸和蛋白质激酶级联等。到目前为止，harpin几乎从所有的革兰氏阴性植物病原细菌中被鉴定出来。Harpin能激活植物生长和防卫反应信号通路，但是，在植物中，一种harpin蛋白在一个信号通路中如何能被识别？一个特定的harpin在植物中的受体是什么？这个信号如何被转导到细胞内？能把细菌效应蛋白，特别是Ⅲ型效应子从植物细胞外转运到细胞内的植物转位子是什么？目前都还不清楚。
　　 本研究使用Hpa1Xoo，它由水稻白叶枯病原细菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）产生，分子量15.6 kD，比其他病原细菌的harpin（最大44 kD）都小，但生物活性强。本研究着重剖析Hpa1Xoo在植物中的亚细胞定位与后续反应之间的关系，质外体的H2O2如何参与植物防卫反应，Hpa1Xoo蛋白在信号通路中如何被植物中的蛋白识别以及识别之后对植物产生的影响。
　　 1.转基因植物产生的Hpa1Xoo蛋白在质外体定位诱导H2O2产生与向细胞质转移及对抗病性的影响已有的研究证明，革兰氏阴性植物病原细菌分泌的harpin蛋白能够激活植物防卫反应信号通路，包括产生于质外体的H2O2信号的转导，但是，一种harpin蛋白在一个信号通路中如何被识别以及质外体的H2O2如何参与防卫反应，还不清楚。本章中，我们研究了来源于水稻白叶枯病原细菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）的harpin蛋白Hpa1Xoo在拟南芥中是否影响了H2O2的产生以及植物的抗病性。把Hpa1Xoo和融合了质外体定位信号基因(S)的Hpa1Xoo（SHpa1Xoo）转入拟南芥，分别产生了转基因拟南芥植株HETAt和SHETAt。本研究发现，转基因拟南芥抗丁香假单胞番茄致病变种菌株DC3000(Pst DC3000)和大白菜软腐病菌菌株RL4(Pcc RL4)。Hpa1Xoo定位于HETAt的细胞质和SHETAt的质外体和细胞膜，H2O2积累于HETAt的细胞质和SHETA的质外体和细胞质。已经知道，质外体中的H2O2是由质膜上的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)产生的，这是植物防卫反应的一个普遍特征。H2O2产生于HETAt的细胞质和SHETAt的质外体，并且产生于质外体的H2O2依赖于NOX。当Hpa1Xoo处理WT植物时，Hpa1Xoo定位于质外体并在质外体中诱导H2O2的产生，但是质外体和细胞质中都有H2O2的积累。在SHETAt和Hpa1Xoo处理的野生型(WT)拟南芥中，如果抑制质外体中H2O2的产生，细胞质中就没有H2O2的积累并且植物失去抗病能力。这些结果说明，Hpa1Xoo诱导的产生于质外体的H2O2在参与植物调节抗病过程中需要从质外体运转到细胞质中。
　　 2.Hpa1Xoo促进转基因拟南芥生长的作用不依赖于H2O2已有的研究证明，harpin能激活植物的生长信号通路。但是，一种harpin蛋白在一个信号通路中如何被识别以及harpin蛋白诱导的H2O2是否参与生长信号通路，还不清楚。在第一章中，我们产生了转基因拟南芥植株HETAt和SHETAt。本研究发现，转基因拟南芥植株HETAt和SHETAt的生长快于对照植株，并且植株体内的与生长相关基因表达增强。在SHETAt中，H2O2的积累依赖于质膜NADPH氧化酶活性，并且H2O2的积累不影响植株的生长。在HETAt中，H2O2含量的上升与NADPH氧化酶无关，H2O2的产生也不影响植株的生长。外施的Hpa1Xoo能促进野生型拟南芥(WT)的生长，Hpa1Xoo诱导的产生于质外体的H2O2以及积累于质外体和细胞内的H2O2与促生长无关。这些实验结果说明，Hpa1Xoo能够激活植物的生长信号通路，并且这个信号通路与Hpa1Xoo诱导的H2O2无关。
　　 3.Hpa1Xoo与PIP1;4蛋白在拟南芥细胞膜上的互作验证前两章已经证明，转入拟南芥的Hpa1Xoo定位于植物的细胞外和细胞内，诱导植物的防卫反应，并能促进植物生长。基于Hpa1Xoo的这些有益表型，本章中，为了试图解析Hpa1Xoo的作用机理，以Hpa1Xoo为诱饵对拟南芥cDNA文库进行筛选，初步筛选到6个阳性克隆，其中包括植物水通道蛋白PIP1;4。通过普通的酵母双杂交体系（Yeast two-hybrid system，Y2H）、膜酵母双杂交体系(Membraneyeast two-hybridsystem，MYTH)、Pull-down assay、双分子荧光互补技术(Bimolecular FluorescenceComplementation，BiFC)和荧光染料的观察证实了Hpa1Xoo与PIP1;4的互作，并且互作发生在植物的细胞膜上。而N端缺失53个氨基酸的Hpa1Xoo蛋白(△NT)则不能与PIP1;4发生相互作用。
　　 4.Hpa1Xoo与PIP1;4蛋白互作促进拟南芥的生长与诱导其抗病的初步研究证实Hpa1Xoo与PIP1;4互作之后，为了研究这两个蛋白的互作对植物产生的影响，从拟南芥研究中心购买了8种atpip1;4拟南芥(CS803583、CS870828、CS872202、CS876999、CS879846、CS879691、CS870571和SALK_147568)种子。这些突变体都是T2代杂合体，通过卡那霉素和Basta抗性筛选，从每一种突变体中都筛选到了纯合体。利用原核表达体系表达了Hpa1Xoo和△NT并用蛋白纯化试剂盒纯化了这两个蛋白。通过表型观察发现，Hpa1Xoo处理的WT拟南芥长势最好，而Hpa1Xoo处理的atpip1;4拟南芥与△NT或水处理的WT和atpip1;4拟南芥生长表型一致，长势都弱于Hpa1Xoo处理的WT。Pst DC3000接种实验发现，Hpa1Xoo处理的WT拟南芥抗病最强，而Hpa1Xoo处理的atpip1;4拟南芥与△NT或水处理的WT和atpip1;4拟南芥易感病。这些试验结果说明，PIP1;4与Hpa1Xoo的互作不仅能够促进拟南芥的生长，也能够诱导拟南芥对病原菌的抗性。

目录

声明

摘要

缩略语

前言

第一部分 文献综述

第一章 植物病原细菌的Ⅲ型泌出系统

一、植物病原细菌的Ⅲ型泌出系统模型

二、植物病原细菌的Ⅲ型泌出系统的结构

三、植物病原细菌的Ⅲ型泌出系统分类与调控

四、植物病原细菌的Ⅲ型伴侣分子

第二章 Harpin的分子遗传学特性及其在植物上作用的信号传导机制

一、Harpin的分子遗传学特性

二、Harpin蛋白在植物上作用的信号机制

三、Harpin在植物上启动的信号通路

四、Harpin启动植物激素信号传导的交叉调控机制

第三章 植物细胞活性氧的研究进展

一、活性氧(ROS)的产生

二、活性氧的信号传递

三、过氧化氢在植物中的作用

第四章 植物水通道蛋白的研究进展

一、水通道蛋白的发现

二、植物水通道蛋白的分类

三、植物水通道蛋白的结构

四、植物水通道蛋白的功能

第二部分 研究报告

第一章 转基因植物产生的Hpa1Xoo蛋白在质外体定位诱导H2O2产生与向细胞质转移及对抗病性的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二章 Hpa1Xoo促进转基因拟南芥生长的作用不依赖于H2O2

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 Hpa1Xoo与PIP1；4在拟南芥细胞膜上的互作研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 Hpa1Xoo与PIP1；4蛋白互作促进拟南芥生长与诱导其抗病的初步研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

全文总结与展望

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文目录

致谢