定量PCR和Western blot结合检测转基因大豆植物组织和商业化大豆相关食品中CP4-EPSPS成分

摘要

随着转基因大豆（Roundup Ready Soya，简称RRS）的普及，食品中转基因成分的标注成为了一项重要的安全议题。本研究采用CTAB试剂，对Biozol抽提法进行改良提取植物组织中的DNA、RNA和蛋白质;进而结合了定量PCR和Western blot来检测转基因大豆不同组织和不同大豆商业化食品中CP4-EPSPS基因和蛋白的表达。
　　 研究证明改良的Biozol一步法从玉米、大豆、苜蓿和黄瓜组织中不仅能一步提取得到相应的RNA和蛋白质，DNA也有明显的条带。其中，获得的RNA和DNA样品经紫外分光光度计测定和琼脂糖凝胶电泳分析证明纯度较高，血红素加氧酶(hemeoxygenase，HO)基因HO-1和钙依赖蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase，CDRK）基因CDRK1的RT-PCR结果呈阳性，所提取的蛋白质也可以用于Western blot分析，且整个提取过程只需3 h;与分别提取RNA、DNA和蛋白质的方法相比，本一步法可同时分离单个样品中的三种产品，避免了样品间的误差，而且提取所得的产物纯度较高，为进一步的研究提供了便利。
　　 进而利用基因水平和蛋白水平两种方法检测不同大豆商业化食品中CP4-EPSPS基因和蛋白的表达。所检食物制品包括转基因植物源食品和同时含有大豆蛋白和肉品的食品。在验证两种方法的可用性之后，本研究实验结果表明在部分所检食物中至少有两条蛋白降解条带被检测到（35.5和24.6 kD）。在豆腐皮和豆干样品中，检测到了一条蛋白降解条带(24.6 kD)，而定量PCR未能在这些样品中检测到CP4-EPSPS基因;相反的，在标注含有大豆蛋白的火腿切片、肉丸和香肠样品中检测到了CP4-EPSPS基因的成分而Western blot却未能检测到蛋白的降解。本研究表明PCR和Western blot的结合可以增加商业化大豆相关食品中的转基因成份检测的准确性，从而进一步地丰富食品中转基因成分检测的理论和实际应用手段。

目录

声明

摘要

缩略语词汇表

第一章 文献综述

1 转基因食品发展现状

2 常用的转基因技术方法

3 常用的转基因检测方法

3．1 核酸水平

3．2 蛋白质水平

4 展望

5 本研究的目的和内容

第二章 改良的一步法提取植物RNA、DNA和蛋白质

1 引言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 试剂及提取方法

3 结果

3．1 RNA和DNA的紫外分光光度计测定和琼脂糖凝胶电泳

3．2 RT-PCR检测

3．3 蛋白质的SDS-PAGE及Western blot检测

4 讨论

第三章 定量PCR与Western blot检测外源CP4-EPSPS基因及其表达蛋白在转基因大豆加工过程及转基因大豆植株中的变化规律

1 引言

2 材料与方法

2．1 材料与试剂

2．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 定量PCR和Western blot的可信度检测

3．2 转基因大豆产品中CP4-EPSPS基因的溯源

3．3 商品化大豆相关食品中CP4-EPSPS基因和蛋白的检测

4 讨论

4．1 定量PCR和Western blot的可信度检测

4．2 转基因大豆产品中CP4-EPSPS基因的溯源

4．3 商业化大豆相关食品中CP4-EPSPS基因和蛋白的检测

5 展望

参考文献

研究生期间发表的研究论文

附件一 CP4-EPSPS基因全序列

附件二 CP4-EPSPS蛋白序列

致谢