水稻C2H2型锌指蛋白ZFP182和ZFP36在ABA诱导的抗氧化防护中的功能分析

摘要

植物特别是作物对非生物逆境（干旱、冷害、高盐环境等）的适应性对于作物的产量和品质有着非常重要的影响，干旱是植物逆境最普遍的形式，在许多地区是农业发展的瓶颈。植物响应干旱胁迫的一种重要反应是积累植物激素脱落酸(abscisic acid,ABA)。水分胁迫下所积累的ABA能增加植物体内ROS的产生和上调抗氧化防护系统的活性，增强植物对水分胁迫的耐性。而在这一信号网络中，一些转录因子如MYB、WRKY、热激因子和多种类型锌指蛋白的含量增加，它们共同参与维持ROS的稳定含量。因而认为这些转录因子家族在植物对逆境的应答过程中起着非常重要的调控作用。但锌指蛋白在ABA诱导的抗氧化防护中的作用机理，尤其与H2O2、MAPK、NADPH氧化酶等ABA信号途径中的主要组分的关系并不清楚。
　　 本研究从水稻中分离参与ABA、H2O2应答反应的锌指蛋白转录因子着手，通过原生质体瞬时表达和转基因技术，使目标转录因子基因过表达或者沉默，通过对比转基因与野生型植株抗氧化防护酶、NADPH氧化酶以及MAPK的基因表达及酶活，深入探讨其在水稻耐逆性中的作用机理，对提高水稻抗逆性的遗传育种改良有重要的理论指导意义。主要研究结果如下:
　　 利用生物信息学和RT-PCR的方法从水稻幼苗的叶片中分离出两个锌指蛋白基因ZFP182和ZFP36，分别与拟南芥ZAT12和ZAT10有较高的同源性。其编码产物都含有两个典型的C2H2型锌指结构，ZFP182编码产物为170个氨基酸残基，分子量为18.215 kDa，而ZFP36编码产物为220个氨基酸，分子量为22.804 kDa。通过亚细胞定位实验发现，这两个锌指蛋白基因均定位于细胞核中。荧光定量RT-PCR分析表明:ABA和H2O2处理后，水稻叶片中ZFP18和ZFP36基因转录水平与对照组相比，出现双阶段快速、瞬时的上调。H2O2清除剂(DMTU)的预处理能有效抑制ABA诱导的ZFP182和ZFP36基因的转录。NO也能上调ZFP182和ZFP36基因的表达;这些结果提示，ABA、H2O2和NO均能诱导ZFP182和ZFP36基因的转录，而且ABA诱导水稻锌指蛋白基因表达增强是通过ABA诱导产生的内源H2O2来起作用的。
　　 为了进一步研究ZFP182和ZFP36的功能，本研究分别构建了ZFP182和ZFP36基因的过量表达(sense)、反义抑制(antisense)和RNA干涉（sense/antisense，dsRNA）的植物表达载体，通过农杆菌介导法转化水稻愈伤组织，成功获得ZFP182的RNA干扰植株;ZFP36的过量表达和反义抑制以及RNA干扰的植株。分别以转基因水稻F1代和野生型水稻为材料，外源ABA处理可以提高细胞内SOD和APX的活性，与野生型相比，RNA干扰及反义抑制的转基因植株的SOD和APX的活性显著降低。通过原生质体瞬时表达体系，我们也发现过表达ZFP182和ZFP36基因可以明显提高SOD和APX酶的活性，而干扰这两个锌指蛋白基因，SOD和APX的活性显著下降。经ABA处理后，SOD和APX的活性均略有上升，实验结果与以转基因植株为材料的结果完全吻合，充分说明了ZFP182和ZFP36基因确实参与了ABA诱导的抗氧化防护反应，而且在其中扮演了重要的角色，对植物增强抗氧化防护，提高胁迫耐性具有重要意义。
　　 真核生物中的MAPK级联系统在外源刺激信号转入胞内应答受体/感应器的下游过程中起枢纽作用。植物ABA信号途径中也有MAPK级联系统的参与。
　　 本研究以水稻幼苗叶片为材料，采用药理学方法和荧光定量RT-PCR技术研究了MAPK和ZFP182和ZFP36基因转录在ABA信号途径之间的关系。MAPKK抑制剂（PD98059和U0126）的预处理能有效抑制ABA诱导的ZFP182和ZFP36基因的转录。在水稻原生质体中，ABA处理能够上调ZFP18和ZFP36的表达。利用dsRNA技术，分别将OsMPK1和OsMPK5基因（分别与AtMPK6和AtMPK3同源）沉默，ABA对ZFP182和ZFP36基因转录的诱导被阻断。而利用dsRNA技术或者RNAi突变体分别使ZFP182和ZFP36基因沉默，OsMPK1和OsMPK5基因的表达不受影响;说明在ABA信号途径中，OsMPKl/OsMPK5和ZFP36/ZFP182呈现出一种直线关系，即OsMPK1和OsMPK5作为ZFP182和ZFP36的上游因子发挥作用。
　　 本实验室已有的研究结果显示ABA及H2O2均可以诱导OsDMI3基因表达，提示这一激酶可能参与干旱与氧化胁迫的信号转导。然而，这一激酶在植物对胁迫反应中涉及的下游元件还不清楚。OsDMI3与锌指蛋白转录因子的关系更是未见报道。本研究发现，钙通道阻断剂EGTA、LaCl3，CaM拮抗剂TFP、W7和CCaMK抑制剂KN-93的预处理能有效抑制ABA诱导的OsZF182和OsZF36基因的转录。通过原生质体瞬时表达及dsRNA技术，干扰OsDMI3基因的表达，能有效的阻断ABA对锌指蛋白基因ZFP182和ZFP36的诱导，暗示在ABA信号途径中，OsDMI3位于ZFP182和ZFP36的上游，调控这两个锌指蛋白基因的表达。有意思的是，利用原生质体瞬时沉默技术和转基因技术，分别干扰ZFP182和ZFP36基因的表达，可以显著降低ABA诱导的OsDMI3基因的转录和活性，暗示ZFP182和ZFP36基因又可以调控OsDMI3基因的表达。上述研究结果表明，在ABA信号通路中，OsDMI3和ZFP182/ZFP36之间可能存在一个交叉对话的机制:OsDMI3作为上游因子调控ZFP182和ZFP36基因的表达，而锌指蛋白ZFP182和ZFP36作为转录因子，可能通过直接作用于OsDMI3的启动子区域或者通过作用于其他的一些激酶或者因子间接的对OsDMI3起调控作用。具体机制还有待于进一步深入的研究。
　　 本实验室以往以玉米叶片作为材料的实验阐明，在ABA信号途经中，NADPH、H2O2和MAPK之间存在一个正反馈调节机制:即ABA诱导ZmrbohA-D基因的转录，增加RBOH的活性，诱导质外体H2O2产生，活化MAPK，继而通过激活相关转录因子从而再次激活Rboh基因的表达，增加RBOH的活性，导至H2O2的进一步产生，形成一个RBOH介导的ROS放大过程。但是，对于ZFP182和ZFP36是否参与这个正反馈调节过程并不清楚。本研究用NADPH的抑制剂(DPI)预处理能有效抑制ABA诱导的ZFP182和ZFP36基因的转录，说明在ABA信号系统中，Osrbohs基因位于ZFP182和ZFP36基因的上游。利用水稻原生质体瞬时表达和dsRNA技术干扰ZFP182或ZFP36基因，对ABA信号相关的OsrbohB和OsrbohI基因转录并无影响。DAB染色结果显示，ABA诱导4h之内，野生型和RNAi的转基因植株中，H2O2的积累并无明显差异。
　　 上述几点暗示，ZFP182和ZFP36基因可能并不参与ABA信号途径中H2O2信号放大的正反馈调节机制，但并不能排除有其它的C2H2型锌指蛋白参与ABA信号途径中H2O2信号放大的正反馈调节机制。

目录

声明

摘要

缩略语

第一章 文献综述

1 植物的耐逆性机制

1．1 离子平衡和渗透调节

1．2 活性氧的清除

1．3 非生物逆境下植物基因的表达及表达产物

2 植物在非生物逆境胁迫下的细胞信号传导

2．1 植物在非生物逆境胁迫下的细胞信号传导的一般途径

2．2 植物非生物逆境胁迫下信号传递的网络系统

2．3 参与植物非生物逆境胁迫信号转导过程的信号分子

3 参与非生物胁迫应答的植物转录因子

3．1 植物转录因子的结构与特性

3．2 参与非生物胁迫应答的植物转录因子

3．3 转录因子在逆境抗性基因工程中的应用

4 本研究的目的和意义

第二章 ABA诱导的水稻锌指蛋白基因ZFP182和ZFP36的基因克隆、生物信息学分析以及亚细胞定位

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 目标基因的预测和克隆

1．3 ZFP182和ZFP36基因及Osactin基因的荧光定量PCR

1．4 ZFP182和ZFP36的亚细胞定位

2 结果与分析

2．1 RNA的纯度检测

2．2 目标基因的确定

2．3 水稻ZFP182和ZFP36基因的序列分析

2．4 ZFP182和ZFP36基因的TA克隆

2．5 ZFP182和ZFP36基因的亚细胞定位

2．6 外源ABA对水稻ZFP182和ZFP36基因表达的影响

2．7 外源H2O2对水稻ZFP182和ZFP36基因表达的影响

2．8 ABA通过内源H2O2调节水稻ZFP182和ZFP36基因表达

2．9 NO参与水稻幼苗叶片ZFP182和ZFP36基因转录水平的调节

3 讨论

第三章 水稻锌指蛋白基因ZFP182和ZFP36参与ABA诱导的抗氧化防护

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 植物表达载体的构建

1．3 重组载体向农杆菌感受态细胞的转化

1．4 ZFP182和ZFP36基因及Osactin基因的荧光定量PCR

1．5 水稻原生质体的分离

1．6 质粒提取

1．7 ZFP182和ZFP36基因dsRNA引物的设计

1．8 ZFP182和ZFP36基因的dsRNA的体外合成

1．9 40％PEG介导转化及ABA处理

1．10 抗氧化酶的测定

1．11 数据统计分析

2 结果与分析

2．1 ZFP182和ZFP36基因的植物表达载体的成功构建

2．2 转化后水稻原生质体总RNA的提取及质量检测

2．3 运用RT-PCR的方法分析使ZFP182和ZFP36基因达到良好沉默效果的dsRNA的用量

2．4 ZFP182和ZFP36过表达检测

2．5 利用原生质体瞬时表达体系研究ZFP182和ZFP36基因过表达对抗氧化防护酶活性的影响

2．6 利用原生质体瞬时表达体系研究生ABA诱导下，ZFP182和ZFP36基因沉默对抗氧化防护酶活性的影响

2．7 转基因植株中目的基因干扰效果的鉴定

2．8 利用转基因水稻，研究在ABA处理下，水稻叶片中细胞抗氧化防护酶APX和SOD总活性的变化

3 讨论

第四章 MAPK参与ABA对水稻幼苗ZFP182和ZFP36基因转录水平的调节

1 材料与方法

1．1 材料与方法

1．2 水稻原生质体的分离

1．3 OsMPK5和OsMPK1基因dsRNA引物、半定量引物以及定量引物的设计

1．4 目标基因的荧光定量PCR

1．5 OsMPK5和OsMPK1基因的dsRNA的体外合成

1．6 40％PEG介导转化及ABA处理

1．7 OsMPK5和OsMPK1基因RT-PCR检测

2 结果与分析

2．1 水稻中MAPK与拟南芥中MAPK同源性比较

2．2 MAPK参与ABA对水稻幼苗ZFP182和ZFP36基因转录水平的调节

2．3 转化后水稻原生质体总RNA的提取及质量检测

2．4 ABA诱导水稻原生质体中ZFP36、ZFP182、OsMPK5和OsMPK1基因表达的时间进程分析

2．5 检测OsMPK5和OsMPK1基因沉默效果

2．6 利用原生质体瞬时表达体系研究在ABA诱导下，OsMPK5和OsMPK1基因沉默对ZFP182和ZFP36基因转录的影响

2．7 利用原生质体瞬时表达体系研究在ABA诱导下，ZFP182和ZFP36基因沉默对OsMPK5和OsMPK1基因转录的影响

2．8 利用转基因水稻，研究在ABA处理下，水稻叶片中OsMPK5和OsMPK1基因转录水平上的变化

3 讨论

第五章 OsDMI3与ZFP182和ZFP36在ABA信号通路中存在交叉对话机制

1 材料与方法

1．1 材料与方法

1．2 水稻原生质体的分离

1．3 OsDMI3基因dsRNA引物、半定量引物以及定量引物的设计

1．4 目标基因的荧光定量PCR

1．5 OsDMI3基因的dsRNA的体外合成

1．6 40％PEG介导转化及ABA处理

1．7 OsDMI3基因RT-PCR检测

1．8 粗酶液提取

1．9 免疫沉淀

1．10 凝胶激酶分析

2 结果与分析

2．1 钙、钙调素及钙调素依赖蛋白激酶抑制剂对ABA诱导的ZFP182和ZFP36基因表达的影响

2．2 转化后水稻原生质体总RNA的提取及质量检测

2．3 ABA诱导水稻原生质体中OsDMI3基因表达的时间进程分析

2．4 检测OsDMI3基因沉默效果

2．5 利用原生质体瞬时表达体系研究在ABA诱导下，OsDMI3基因沉默对ZFP182和ZFP36基因转录的影响

2．6 利用原生质体瞬时表达体系研究在ABA诱导下，ZFP182和ZFP36基因沉默对OsDMI3基因转录的影响

2．7 利用原生质体瞬时表达体系研究在ABA诱导下，ZFP182和ZFP36基因沉默对OsDMI3激酶活性的影响

2．8 利用转基因水稻，研究在ABA处理下，水稻叶片中OsDMI3基因转录水平上的变化

3 讨论

第六章 ZFP182和ZFP36基因可能不参与ABA信号途经中NADPH、H2O2和MAPK之间的正反馈调节通路

1 材料与方法

1．1 实验材料与处理

1．2 过氧化氢的组织化学定位

1．3 水稻原生质体的分离、dsRNA的合成以及转化

1．4 OsrbohA-I基因的定量引物的设计

1．5 OsrbohA-I基因及Osactin基因的荧光定量PCR

2 结果与分析

2．1 ABA诱导的H2O2组织化学定位

2．2 水稻中OsrbohA-I与拟南芥AtrbohD、AtrbohF以及玉米ZmrbohA-D同源性比较

2．3 转化后水稻原生质体总RNA的提取及质量检测

2．4 ABA诱导水稻原生质体中OsrbotM-I基因表达的时间进程分析

2．5 利用原生质体瞬时表达体系研究在ABA诱导下，ZFP182和ZFP36基因沉默对OsrbohB和OsrbohI基因转录的影响

3 讨论

3．1 ABA诱导水稻原生质体中OsrbohB和OsrbohI基因的表达

3．2 ZFP182和ZFP36基因可能不参与ABA信号途径中H2O2信号放大的正反馈调节机制

第七章 全文结论

1 研究小结

1．1 ZFP182和ZFP36基因的克隆、生物学分析以及亚细胞定位

1．2 水稻锌指蛋白基因ZFP182和ZFP36参与ABA诱导的抗氧化防护

1．3 MAPK参与ABA对ZFP182和ZFP36基因转录水平的调节

1．4 OsDMI3与ZFP182和ZFP36在ABA信号通路中存在交叉对话机制

1．5 ZFP182和ZFP36基因可能不参与ABA信号途经中NADPH、H2O2和MAPK之间的正反馈调节通路

2 创新之处

3 存在问题与展望

参考文献

致谢

攻读博士期间发表与投送的学术论文

附录