二穗短柄草(Brachypodium distachyon)T-DNA插入突变体库构建

摘要

二穗短柄草(Brachypodium distachyon)是一种温带禾本科植物，其植株矮小、自花授粉、生活周期短、生长条件简单、基因组小、易于进行遗传转化等，是温带禾本科植物功能基因组学研究的理想模式植物。随着二穗短柄草基因组测序及注释的正式完成，对基因功能的研究己成为重点，研究基因功能最直接和有效的方法是构建二穗短柄草突变体库。T-DNA的插入是突变体库构建的重要方法之一。本研究利用已完成全基因租序列测定的二穗短柄草BD21，采用农杆菌介导T-DNA插入法获得突变体库，以对其近缘作物小麦、玉米、水稻、牧草、草坪草等的研究起到应有的作用。主要结果如下:
　　 1.二穗短柄草高效离体再生体系的建立
　　 试验主要以二穗短柄草三个品系BD21，BD21-3和BD018幼胚为外植体，研究了胚的大小对愈伤组织的诱导和再生的影响。选取BDB21，BD21-3，BDR018三个品系的未成熟胚，将其分为小于0.3mm、0.3mm～0.5mm和大于0.5mm三个等级进行诱导培养，结果发现，三个品系中大小介于0.3mm～0.5mm之间的未成熟胚诱导率均较高，分别为88.6％、87.6％、74.2％，其中BD018愈伤的再生能力最强。
　　 2.二穗短柄草遗传转化体系的优化
　　 选取BD018为试验材料，选取不同菌株AGL0、AGL1、EHA105、LBA4404（均含有质粒pDM805）侵染，结果表明AGL1的侵染效果较好。对于抗性筛选标记，hpt基因筛选效果显著好于bar基因，在一定程度上节约了突变体库的构建成本。
　　 3.选取BD21为试验材料，利用T-DNA插入法构建突变体库，已成功共获得3000多个独立转化株系，预期获得15000个独立转化株系。

目录

声明

摘要

主要缩略语

第一章 文献综述

1 二穗短柄草(Brachypodium distachyon)研究现状

1．1 二穗短柄草的生物学特性

1．2 二穗短柄草的基因组学研究

1．3 二穗短柄草的研究应用

2 二穗短柄草突变体库的构建策略和进展

2．1 物理诱变

2．2 化学诱变

2．3 插入突变

3．农杆菌介导二穗短柄草的遗传转化

3．1 研究的起始

3．2 二穗短柄草转基因的主要方法

3．3 农杆菌转化是构建二穗短柄草突变体库的关键

4 展望

第二章 二穗短柄草未成熟胚再生体系建立

1 材料

1．1 植物材料

1．2 培养基

2 方法

2．1 未成熟种子的消毒

2．2 愈伤组织的诱导和继代

2．3 愈伤组织的再生

2．4 数据统计

3 结果与分析

4 讨论

第三章 二穗短柄草转化体系优化

1．不同菌株对侵染效率的影响

1．1 植物材料及菌株

1．2 质粒载体的构造

1．3 转化受体材料的准备

1．4 农杆菌的培养

1．5 农杆菌的侵染过程

1．6 转化体的筛选与抗性植株再生

1．7 GUS基因表达检测

1．8 转化植株的PCR鉴定

2 不同筛选标记基因对于筛选效果的影响

2．1 植物材料及质粒

2．2 质粒载体的构造

2．3 转化受体材料的准备

2．4 农杆菌的培养

2．5 农杆菌的侵染过程

2．6 转化体的筛选与抗性植株再生

2．7 GUS基因表达检测

2．8 转化植株的PCR鉴定

3 结果与分析

3．1 不同菌株对侵染效率的影响

3．2 不同筛选标记基因对于筛选效果的影响

3．3 转基因植株的鉴定

4 讨论

4．1 不同菌株对侵染效率的影响

4．2 不同筛选标记基因对筛选效果的影响

4．3 关于遗传转化

第四章 农杆菌介导二穗短柄草T-DNA插入突变体库构建

1 材料

1．1 植物材料及菌株

1．2 质粒载体的构造

2 方法

2．1 转化受体材料的准备

2．2 农杆菌的培养

2．3 农杆菌侵染过程

2．4 转化体的筛选与抗性植株再生

2．5 绿色荧光蛋白(GFP)基因表达分析

2．6 转化植株的PCR鉴定

3 结果与分析

3．1 GFP绿色荧光蛋白的检测

3．2 转基因植株的PCR检测

4 讨论

第五章 研究结论

参考文献

致谢