叶蝉诱导的茶树重要防御相关基因的功能解析和互利素鉴定应用

摘要

茶树（Camellia sinensis）起源于中国西南部，是一种重要的经济作物。茶叶为世界三大无酒精饮料之一。茶树在生长过程中常常受到各种各样植食性昆虫的为害，但是茶叶的饮用方法又决定了化学农药的使用是受到限制的。随着人们对茶叶产品的卫生质量和安全性要求越来越高，减免化学农药的使用量势在必行。当茶树遭受植食性昆虫攻击时，会释放一系列复杂的挥发物，这些挥发物能够吸引天敌到受害植物寻找寄主或猎物，因而对植物和植食性昆虫的天敌均有利，称之为互利素，作为化学信号为茶树、植食性昆虫及其天敌提供有价值的信息。研究和利用这些挥发物，通过提取和合成挥发物或通过转基因植物释放的挥发物来调控昆虫的行为，抵御害虫危害，显示了极大的潜力。本文主要研究内容结论如下:
　　 (1)茉莉酸类物质的生物合成途径是虫害诱导的主要途径，在植物虫害诱导防御过程中起着主导作用。而丙二烯氧化物环化酶(AOC)是茉莉酸类物质生物合成途径中最为关键的酶，它环化在AOS催化反应下生成的不稳定化合物-丙二烯氧化物，生成茉莉酸产物的最终前体物质12-氧-植物二烯酸(OPDA)。本文首次在茶树中克隆了该酶基因，采用RACE技术获得了茶树AOC全长cDNA序列（CsAOC，Genbank登录号:HQ889679）。其cDNA全长为916 bp，包括5'和3'非翻译区、poly(A)尾和一个长738 bp的开放阅读框(ORF)。CsAOC基因组DNA含有两个内含子，分别为115 bp和369 bp。CsAOC基因编码的蛋白质有245个氨基酸，分子量为26.5 kDa，理论等电点为9.0。没有信号肽，但有一个叶绿体转运肽。多重比对结果表明CsAOC蛋白与其他的AOC蛋白具有较高的同源性。预测了CsAOC的二级结构组成，由21.22％α-螺旋、25.31％延伸主链、6.12％β-转角和47.35％随机卷曲组成。成功构建了CsAOC的原核表达载体，结果表明表达出来的蛋白与所预期的蛋白大小一致。该表达蛋白主要以包涵体形式存在。RT-QPCR结果表明，CsAOC基因可被多种不同诱导因素所诱导，MeJA的诱导最为显著，SA和机械损伤也都明显提高了CsAOC的表达水平。受茶尺蠖和假眼小绿叶蝉危害处理后CsAOC的转录均出现上调。因此，可以借以调控AOC基因的表达和JAs的合成。
　　 (2)在植物群落中，萜类化合物作为一种行为信号的化学信号在植物之间以及植物与昆虫之间起着重要的作用，因此，萜类化合物的生物合成途径在植物的防御反应中起着非常重要的作用。而3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是该途径中的第一个限速酶，是细胞质萜类化物代谢中的重要调控点。本文首次克隆获得了茶树3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（CsHMGR）的全长cDNA序列(Genbank登录号:JN584161)。其cDNA全长为2051 bp，包括5'和3'非翻译区、poly(A)尾和一个长1773 bp的开放阅读框(ORF)。CsHMGR基因组DNA含有两个内含子，分别为136 bp和108 bp。CsHMGR基因编码的蛋白质有590个氨基酸，分子量为63.38 kDa，理论等电点为6.68。多重比对结果表明CsHMGR蛋白与其他的HMGR蛋白具有较高的同源性。预测了CsHMGR的二级结构组成，由21.22％α-螺旋、25.31％延伸主链、6.12％β-转角和47.35％随机卷曲组成。三级结构中则含有两个NADP(H)结合域和两个HMG-CoA结合域。成功构建了CsHMGR的原核表达载体，结果表明表达出来的蛋白与所预期的蛋白大小一致。该表达蛋白主要以包涵体形式存在。
　　 (3)为有效利用植物互利素诱集缨小蜂类寄生茶园假眼小绿叶蝉的卵，遂分别以新鲜的健康茶梢、叶蝉为害茶梢、健康嫩茎、叶蝉产卵嫩茎为味源材料，使用SuperQ为吸附剂，以空气夹带法吸附挥发物，有机溶剂淋洗，氮气吹扫浓缩，使用GC-MS配合标准样品予以定性分析。结果表明，在蝉害茶梢和蝉害茎中发现了组分(E, E)-α-法尼烯，并且含量显著。根据以往研究基础得知，在茶园中，(E，E)-α-法尼烯对叶蝉三棒缨小蜂和微小裂骨缨小蜂具有很强的引诱力。夏秋两季在不同地区分别使用多种蝉害茶梢挥发物诱集这两种缨小蜂，均以(E，E)-α-法尼烯效果最好。(E，E)-α-法尼烯与苯甲醛、反-2-己烯醛组成的混合物与素馨黄色板的组合，可有效诱集这两种缨小蜂寄生假眼小绿叶蝉的卵。本文为利用茶树互利素诱集缨小蜂制约假眼小绿叶蝉提供了参考。
　　 (4)通常，7月上中旬和10月份，茶园中天敌昆虫种类比较丰富，个体数量较多，适合于进行多种互利素诱集效果的比较，筛选出诱效较强的互利素、或互利素配方。本文基于课题组之前的室内行为测定结果，将多种互利素及其混合物制成诱芯，悬挂于素馨黄粘板上，于茶园中检测互利素及其混合物对于各种天敌的引诱效应，比较和筛选诱效最佳的组分。结果表明，诱集的天敌昆虫种数之间、个体数之间和多样性指数之间的差异都比较显著。正己烷和青叶醇引诱天敌昆虫的效应在物种数和个体数方面是最少的，但在多样性指数方面较高。叶蝉为害激活了茶树防御相关基因，释放出挥发性互利素，诱集缨小蜂等天敌昆虫寄生叶蝉，抑制叶蝉种群。本研究为利用互利素诱集天敌控制害虫提供参考。

目录

声明

摘要

中英文缩略表

第一章 绪论

1．1 茉莉酸类物质的生物合成途径与植物的防御反应

1．1．1 茉莉酸类物质是植物防御反应的重要信号分子

1．1．2 茉莉酸类物质的生物合成途径及其中的关键酶

1．1．3 茉莉酸类物质与植物的抗虫性

1．2 萜类物质的生物合成途径与植物的防御反应

1．2．1 萜类物质在植物防御反应中的作用

1．2．2 萜类物质的生物合成途径及其中的关键酶

1．3 植物挥发性互利素的主要化学成分、释放机制及防御作用

1．3．1 植物挥发性互利素的主要化学成分

1．3．2 植物挥发性互利素的释放机制

1．3．3 植物挥发性互利素在植物防御反应中的作用

1．4 研究的目的与意义

第二章 茶树茉莉酸类物质生物合成途径丙二烯氧化物环化酶基因(AOC)的克隆与功能分析

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 结果与分析

2．3．1 RNA提取

2．3．2 CsAOC基因中间序列的扩增

2．3．3 CsAOC基因3’端序列的扩增

2．3．4 CsAOC基因5’端序列的扩增

2．3．5 CsAOC cDNA的全长克隆和性质分析

2．3．6 CsAOC基因组序列

2．3．7 CsAOC推导的蛋白质序列的性质分析

2．3．8 茶树与其他作物AOC基因编码的氨基酸序列同源性及序列联配

2．3．9 CsAOC基因进化树的构建

2．3．10 CsAOC蛋白的二级结构

2．3．11 CsAOC原核表达

2．3．12 CsAOC基因表达分析

2．4 讨论

第三章 茶树倍半萜类物质生物合成途径3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A基因(HMGR)的克隆与功能分析

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 试验材料

3．2．2 实验方法

3．3 结果与分析

3．3．1 RNA提取

3．3．2 CsHMGR基因中间序列的扩增

3．3．3 CsHMGR基因5’端序列的扩增

3．3．4 CsHMGR基因3’端序列的扩增

3．3．5 CsHMGR cDNA的全长克隆和性质分析

3．3．6 CsHMGR基因组序列

3．3．7 CsHMGR推导的蛋白质序列的理化性质分析

3．3．8 茶树与其他作物HMGR基因编码的氨基酸序列同源性及序列联配

3．3．9 茶树HMGR基因编码的氨基酸序列的分析系统进化分析

3．3．10 茶树HMGR的疏水性／亲水性的预测与分析

3．3．11 茶树HMGR跨膜结构域的预测与分析

3．3．12 茶树HMGR信号肽的预测与分析

3．3．13 茶树HMGR亚细胞定位的预测与分析

3．3．14 茶树HMGR结构功能域的分析

3．3．15 茶树HMGR二级结构的预测与分析

3．3．16 茶树HMGR三级结构的预测与分析

3．3．17 CsHMGR原核表达

3．4 讨论

第四章 叶蝉为害诱导的茶树互利素分离鉴定及其诱集缨小蜂的效应

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 叶蝉为害茶梢和嫩茎的挥发物分离鉴定

4．2．2 茶园中几种茶树互利素素对缨小蜂引诱效应

4．2．3 互利素诱集缨小蜂寄生叶蝉的效应

4．3 结果和分析

4．3．1 挥发物的分离鉴定

4．3．2 浙江省武义县和安徽省宣城市茶园中几种互利素有效地诱集两种缨小蜂

4．3．3 互利素可有效地诱集缨小蜂类寄生叶蝉卵

4．4 讨论

第五章 茶树互利素对于茶园天敌昆虫的诱集效应

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 素馨黄粘板的制作

5．2．2 互利素诱芯的制作

5．2．3 田间诱捕试验

5．2．4 数据分析

5．3 结果和分析

5．3．1 几种互利素诱集的天敌昆虫种数之间的差异显著

5．3．2 几种互利素诱集的天敌昆虫个体数之间的差异显著

5．3．3 几种互利素诱集的天敌昆虫多样性指数之间的差异显著

5．3．4 不同互利素诱集的天敌类群有明显差异

5．4 讨论

全文总结

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文目录

致谢