番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定、遗传多样性分析及其诱导抗性相关基因的分离

摘要

番茄（Solanum lycopersicum Mill.）由于其营养丰富，口味独特，已成为世界性的蔬菜作物之一。随着番茄栽培面积的增加，诸多不利因素（如生物胁迫和非生物胁迫）制约了番茄产业的发展。其中番茄黄化曲叶病毒病(Tomato Yellow Leaf Curl VirusDisease，TYLCD)是番茄生产上最严重的病害之一。为了更有效地分析其致病机理，本研究克隆浙江省番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus，TYLCV)分离物的全长序列，分析其结构特征，序列同源性及系统发育关系;为了进一步分析其遗传多样性，我们从NCBI网站上检索TYLCV，分析来源于29个国家48个地区TYLCV的基因结构、GC含量、保守性比对及其遗传变异;此外，利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测抗感番茄接种前后病毒含量的差异，讨论与其抗性程度的相关性;最后，利用cDNA-AFLP技术分离了TYLCV诱导抗病相关基因。研究结果如下:
　　 1.TYLCV的分子鉴定及序列分析
　　 运用PCR技术克隆并鉴定了浙江省杭州地区TYLCV分离物，病毒基因全长为2781个核苷酸，共编码6个开放阅读框（AV1、AV2、AC3、AC2、AC1、AC4），即为TYLCV的典型结构;核苷酸序列比对分析发现该病毒分离物与美国的TYLCV同源性最高(99.6％);6个编码区分析显示除云南外，AV2与国内其他地区同源性均高达100％;系统发育关系分析表明病毒分离物与江苏、北京、美国、墨西哥的TYLCV划分为一类，亲缘关系最近。
　　 2.TYLCV的遗传多样性分析
　　 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)上共检索到48个TYLCV; GC含量分析表明没有较大差异，随着核苷酸长度的变化趋势较一致;序列比对表明这些TYLCV的保守性很高;系统发育关系分析这些TYLCV被分为10类;同源性分析显示，序列间差异较大，序列间同源性最低为72.8％，最高为98.6％。
　　 3.TYLCV的定量分析
　　 利用qRT-PCR技术对抗、感番茄材料在接种后不同时期病毒含量进行分析，结果表明:接种后同一时期抗病材料的病毒含量总体低于感病材料;除TY-1+2+3+5番茄材料，其它抗病番茄材料的病毒含量随着时间的增长均呈现先升高后降低的趋势;番茄材料的病毒含量与抗性呈现一致性。
　　 4.运用cDNA-AFLP技术分离番茄抗TYLCV的差异表达基因
　　 利用cDNA-AFLP技术分离抗病番茄在接种后不同时期的差异表达基因，结果表明:共筛选出287条转录差异片段，其中156条上调表达，131条下调表达;对其中15个转录表达片段（Transcript-derived fragment，TDF）进行序列分析，11个TDF与NCBI已有序列同源，功能涉及代谢、信号传导、转录调控、DNA结合以及逆境诱导蛋白，另有4个TDF无同源序列或同源性低，预测是一些未知功能基因。
　　 总之，这些结果一方面为今后揭示TYLCV的致病机理及番茄黄化曲叶病毒病的诊断和防治提供科学依据;另一方面为番茄与TYLCV的互作、番茄抗TYLCVD相关基因功能研究奠定基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 番茄的重要性

2 番茄黄化曲叶病毒病的发生、危害及防治措施

2．1 番茄黄化曲叶病毒病的发生和危害

2．2 烟粉虱—番茄黄化曲叶病毒病的传播介体

2．3 番茄黄化曲叶病毒病的防治措施

3 番茄抗黄化曲叶病毒及其抗病研究进展

3．1 番茄黄化曲叶病毒的研究

3．2 番茄黄化曲叶病毒的检测

3．3 番茄黄化曲叶病毒的接种鉴定

3．4 抗病性遗传规律及抗病基因

4 实时荧光定量PCR技术

4．1 实时荧光定量PCR的原理及特点

4．2 实时荧光定量PCR的方法

5 cDNA-AFLP技术

5．1 差异基因的表达方法

5．2 cDNA-AFLP技术在抗病相关基因表达研究中的应用

第二章 番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定及序列分析

1 材料与方法

1．1 病毒样品的采集及总DNA提取

1．2 PCR扩增、克隆和序列测定

1．3 序列同源性分析及系统进化树的构建

2 结果与分析

2．1 番茄黄化曲叶病毒的田间感病表现和初步鉴定

2．2 黄化曲叶病毒的全长及其基本结构

2．3 黄化曲叶病毒的同源性及聚类分析

3 讨论

第三章 番茄黄化曲叶病毒的遗传多样性分析

1 材料和方法

1．1 番茄黄化曲叶病毒序列的检索及基本结构

1．2 番茄黄化曲叶病毒的GC含量计算

1．3 番茄黄化曲叶病毒的保守性比对

1．4 番茄黄化曲叶病毒系统进化树的构建

1．5 番茄黄化曲叶病毒的同源性比对

2 结果与分析

2．1 番茄黄化曲叶病毒的检索

2．2 番茄黄化曲叶病毒的基本结构特征分析

2．3 番茄黄化曲叶病毒的GC含量分析

2．4 番茄黄化曲叶病毒的保守性分析

2．5 番茄黄化曲叶病毒的系统发育关系分析

2．6 番茄黄化曲叶病毒的同源性分析

3 讨论

第四章 番茄黄化曲叶病毒的定量分析

1 材料方法

1．1 番茄材料及番茄黄化曲叶病毒的接种

1．2 病级统计及DNA提取

1．3 常规PCR检测

1．4 荧光定量PCR技术

1．5 数据分析

2 结果与分析

2．1 病情指数

2．2 常规PCR与qRT-PCR检测

2．3 番茄黄化曲叶病毒的定量分析

3 讨论

第五章 利用cDNA-AFLP技术分析抗黄化曲叶病毒病相关基因差异表达

1 材料与方法

1．1 材料与番茄黄化曲叶病毒的接种

1．2 总RNA的提取及双链cDNA的合成

1．3 cDNA-AFLP技术

1．4 差异片段的回收、克隆及测序

2 结果与分析

2．1 RNA和cDNA质量检测

2．2 酶切、连接和预扩产物的检测

2．3 cDNA-AFLP的差异表达分析

2．4 差异表达片段的序列分析

3 讨论

全文总结

参考文献

攻读硕士期间发表论文情况

致谢