检测猪乙脑抗体的EDⅢ抗原间接ELISA与血凝抑制和蚀斑减少中和试验的相关性研究

摘要

日本脑炎（Japaneseencephalitis，JE）又称流行性乙型脑炎，简称乙脑，是一种经蚊子传播的，由黄病毒科黄病毒属的日本脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）引起的人畜共患病。人和马的乙型脑炎临床特征是发热和脑炎，猪乙型脑炎主要表现为母猪流产和公猪睾丸炎。猪感染JEV后病毒血症持续时间长，滴度高，是JEV在自然界的扩增宿主。目前没有针对JE治疗的特效药，预防性疫苗接种是防控该病的主要措施之一。因此，对JEV易感动物群体的免疫状态及时有效的监测就显得十分重要。JEV囊膜蛋白(EnvelopeProtein,E)结构域Ⅲ(DomainⅢ，EDⅢ)是JEV主要结构蛋白E蛋白上的抗原结构域，能激发机体产生病毒特异性的体液免疫，在宿主抗JEV感染致病中起重要作用。血凝抑制试验(HemagglutinationInhibitiontest，HI)和蚀斑减少中和试验（PlaqueReductionNeutralizationTest，PRNT）是检测JEV抗体的经典方法。但是因为这些检测方法对试验材料、操作者的熟练度和特殊设备的依赖而在临床的广泛应用受到限制，酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前检验常用的免疫学检测方法之一，主要因为其操作简单，检测快速，敏感性、特异性强，检测量大。但是ELISA检测结果的临床意义评价需要大量相关流行病学数据来支持。因此，本研究在实验室前期研究的基础上对检测JEV抗体的间接ELISA检测方法进行完善，对比检测临床血清样品，分析间接ELISA结果与HI以及PRNT检测结果的相关性，从而为建立JEVEDⅢ抗原间接ELISA提供临床意义的评价指标，为JEV抗体ELISA试剂盒的研制奠定基础。具体研究内容如下:
　　1.原核表达乙脑病毒EDⅢ抗原进行间接ELISA的研究
　　本试验室构建保存的pET-28a-EDⅢ的BL21甘油茵，经表达条件优化，EDⅢ蛋白在大肠杆菌中IPTG低温诱导，呈可溶性表达，但是表达量低;37℃诱导表达EDⅢ可呈包涵体表达，以包涵体形式大量存在。通过His标签亲和层析柱分离纯化，得到较纯的EDⅢ蛋白，经三次表达纯化，测得平均蛋白浓度为2.84mg/mL，平均每升菌液可得9.4mg纯化的蛋白。用Westenblot分析所表达的蛋白可以与JEV阳性抗体特异性反应，表明包涵体表达的EDⅢ蛋白具有良好的反应原性，可作为包被抗原。用纯化的EDⅢ蛋白作为包被抗原，对各项反应条件进行优化，建立了检测JEV抗体的间接ELISA方法。确定ELISA的最佳反应条件如下，包被浓度0.7μg/mL，4℃过夜;1％BSA的PBST4℃封闭过夜;待检血清稀释度为1∶40，37℃作用1h;二抗1∶5000(0.2μg/mL)稀释，37℃作用1h。阴阳性判断，以OD450nm≥0.436判定为阳性，OD450nm≤0.363为阴性，中间值为可疑，复检仍为可疑值时判定为阴性，即OD450nm＜0.436即判定为阴性。通过特异性试验表明与蓝耳病，猪瘟，伪狂犬病等的阳性血清OD45nm值低，无交叉反应。批间和批内重复性试验效果较好。此方法具有良好的特异性、重复性和敏感性。
　　2.乙脑病毒EDⅢ抗原间接ELISA与血凝抑制及蚀斑减少中和试验的相关性研究
　　用间接ELISA检测127份猪血清中JEV抗体，再对其进行HI效价测定，最后对其中21份进行PRNT，以测定其中和效价。经配对卡方检验表明，HI对ELISA的灵敏度为72.5％，特异度为52％，两种方法的符合率为68.5％，两种检测方法差异不显著(X2=5.535，P=0.17＞0.05);PRNT对HI试验的灵敏度为72.2‰特异度为33.3％，两种方法判定的符合率为66.7％，差异性不显著(X2=0.039，P=0.453＞0.05);PRNT对ELISA的敏感度为80.0％，特异度为50.0％，两种方法判定的符合率为71.4％，差异不显著(X2=1.890，P=1＞0.05)。说明此三种检测方法都能有效检测猪血清中的乙脑抗体水平，但是ELISA检测更为敏感。
　　3.猪血清乙脑抗体的流行病学调查
　　为更好地了解不同免疫背景的猪血清中乙脑抗体水平，用建立的乙脑病毒EDⅢ抗原间接ELISA方法，对339份不同乙脑疫苗免疫的猪血清，以及安徽、江苏不同规模猪场采集的不同免疫背景的猪血清进行检测分析。并对不同地区、不同规模猪场以及不同免疫程序的猪血清中乙脑抗体流行情况进行分析。结果表明，乙脑抗体流行按照猪场所在地区、猪场规模化程度以及免疫程序，呈现一定的规律性;其次也表明所建立的EDⅢ抗原间接ELISA能真实反应乙脑抗体水平，为后续乙脑抗体检测试剂盒的研制提供了较详实可靠的依据。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一篇 文献综述

第一章 流行性乙型脑炎概述

1 流行性乙型脑炎病毒基因结构和病毒粒子结构

2 流行性乙型脑炎的流行特点、分布区域、及发病的规律

3 流行性乙型脑炎的危害以及发病的临床症状

4 流行性乙型脑炎的诊断，预防及治疗

5 乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ(EDⅢ)研究进展

参考文献

第二篇 试验部分

第一章 原核表达乙脑病毒EDⅢ抗原进行间接ELISA方法的研究

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 讨论

参考文献

第二章 乙脑病毒EDⅢ抗原间接ELISA与血凝抑制和蚀斑减少中和试验的相关性研究

1 试验材料

2 试验方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三章 应用间接ELISA进行猪流行性乙型脑炎血清流行病学调查

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 讨论

参考文献

全文总结

附录

致谢