苏、鲁、川地区禽坦布苏病毒病的流行情况调查及三重抗体ELISA方法的建立

摘要

为了解坦布苏病毒病在我国家禽类中的流行情况，应用间接ELISA方法对江苏、山东、四川的鸭、鸡和鹅进行了抗坦布苏病毒抗体测定，并对可疑病例的病料进行了病毒分离。2012年5月至2013年1月江苏省抗体阳性率为78.5％(142/181)，四川省抗体阳性率为0(0/40)。其中抗体阳性地区绍兴鸭（蛋鸭）的抗体阳性率为90.9％(100/110)，枫叶鸭（种鸭）为65.6％(40/61)，樱桃谷鸭（种鸭）为20％(2/10)。通过对南京某鸭群多次抗体检测结果表明，5月和次年1月抗体水平较低，9月抗体水平较高，5月到9月份抗体水平呈升高趋势，9月到次年1月呈下降趋势。
　　2012年10月至2013年1月江苏部分地区的84份鸡血清（卵黄）抗坦布苏病毒抗体总体阳性率为57.1％(49/84)。溧阳抗体阳性率为84.6％(11/13);南京抗体阳性率为57.7％(15/26);镇江抗体阳性率为51.1％(23/45)。蛋鸡的抗体阳性率为66.7％(26/39)，肉鸡的抗体阳性率为51.1％(23/45)。应用套式RT-PCR方法检测10份肉鸡可疑病料，结果病原阳性率为0(0/10)。
　　应用酶标鸭二抗间接ELISA方法对2012年6月至2013年3月采集的江苏、山东、四川的317份鹅血清进行测定，江苏抗体阳性率为55.8％(144/258);山东抗体阳性率为23.1％(9/39);四川抗体阳性率为0(0/20)。抗体阳性地区肉鹅的抗体阳性率为75.5％(102/135);种鹅抗体阳性率34.1％(42/123);朗德鹅抗体阳性率为23.1％(9/39)。应用套式RT-PCR方法检测43份肉鹅可疑病料，结果病原阳性率为4.65％(2/43)，通过接种鸡胚获得2株坦布苏病毒，病毒NS5部分基因测序结果表明，2个毒株与近年分离的禽坦布苏病毒同源性均在99％以上。
　　用提取的鹅IgG免疫绵羊，三次免疫后，当抗鹅抗体达到较高滴度时进行采血，辛酸硫酸铵法提取羊血清中的抗鹅IgG抗体，纯化后用于ELISA方法检测鹅血清中的抗坦布苏病毒抗体。该ELISA方法的程序是以纯化的重组E蛋白作为包被抗原，加入鹅血清，再加入自制的羊抗鹅二抗，最后加入酶标兔抗羊抗体，加入底物显色。通过对试验条件进行优化，确定最佳抗原包被浓度为4μg/ml,抗原包被最适条件为4℃包被过夜;血清抗体最佳稀释度为1∶28;羊抗鹅二抗最佳稀释倍数为1∶400，最佳作用时间为2h;三抗最佳稀释倍数为1∶8000，最佳作用时间为1h;结果判定采用以X+3SD为阴阳性临界值的判定标准。测定了该方法的敏感性和可重复性。应用建立的ELISA方法检测了80份采自山东和江苏的鹅血清，结果显示抗体总阳性率为65％(52/80)。而用鸭二抗ELISA方法检测的抗体阳性率为52.5％(42/80)，两种方法阳性符合率为80.8％(42/52)，阴性符合率为73.7％(28/38)。

目录

声明

摘要

英文缩略表

引言

第一章 文献综述

1 病原学

1．1 病毒形态及理化特性

1．2 病毒培养特性

2 分子生物学

2．1 基因结构及复制机制

2．2 编码的蛋白

3 流行病学

4 临床症状与病理变化

5 诊断方法

5．1 病毒分离

5．2 分子生物学检测

5．3 血清学检测

6 防治

第二章 鸭坦布苏病毒病流行情况调查

1 材料

1．1 病毒株、重组E蛋白、阴阳性血清、阴阳性卵黄抗体

1．2 主要试剂

1．3 主要实验仪器

2 方法

2．1 调查地点选取

2．2 流行病学调查

2．3 样品采集

2．4 间接ELISA方法

3 结果

3．1 江苏及四川样品ELISA检测结果

3．2 不同采样时间的鸭坦布苏病毒抗体效价变化

3．3 不同品种鸭抗体阳性率结果

4 讨论

第三章 鸡坦布苏病毒病流行情况调查

1 材料

1．1 重组E蛋白、阴阳性血清、阴阳性卵黄抗体

1．2 主要试剂

1．3 主要实验仪器

2 方法

2．1 样品采集与处理

2．2 间接ELISA

2．3 套式RT-PCR检测

3 结果

3．1 江苏不同地区ELISA检鸡样品测结果

3．2 不同品种鸡抗体阳性率结果

3．3 套式RT-PCR检测结果

4 讨论

第四章 鹅坦布苏病毒病流行情况调查

1 材料

1．1 主要试剂及菌种

1．2 主要实验仪器

2 方法

2．1 流行病学调查

2．2 样品采集与处理

2．3 间接ELISA检测

2．4 套式RT-PCR检测

2．5 PCR阳性产物鉴定及回收

2．6 胶回收产物与T载体的连接

2．7 DH5α感受态细胞的制备

2．8 连接产物的转化

2．9 重组质粒的提取

2．10 重组质粒的鉴定

2．11 NS5基因的序列测定与分析

3 结果

3．1 发病情况调查及剖检病变观察结果

3．2 江苏、山东与四川样品ELISA检测结果

3．3 不同品种鹅抗体阳性率结果

3．4 套式RT-PCR检测结果

3．5 重组质粒的鉴定

3．6 NS5基因部分片段的序列分析结果

4 讨论

第五章 三重抗体ELISA方法的建立

1 材料

1．1 实验动物

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 羊抗鹅二抗的制备

2．2 ELISA方法的建立

2．3 江苏部分地区鹅血清样品的检测

3 结果

3．1 粗提蛋白含量与纯度检测结果

3．2 免疫双扩散结果

3．3 ELISA反应条件优化结果

3．4 江苏，山东部分地区鹅血清检测结果

4 讨论

参考文献

全文总结

致谢