南通小方柿DkADH1基因的克隆及功能分析

摘要

柿（Diospyros kaki Linn.）是我国重要的果树树种之一，根据脱涩的难易程度，可分为甜柿和涩柿两大类。涩柿原产于我国，资源丰富，具有丰产、抗性强、品质优、耐贮运等特点，是世界栽培数量最大的类型。‘南通小方柿’（Diospyros kaki Linn.cv.Nantongxiaofangshi）（当地俗称小方柿）是江苏省南通地区的著名地方品种，现有栽培面积10万余亩。该品种具有树体矮小、早果、丰产稳产、无核、质优、易脱涩等特点，是我国珍贵的矮生型柿子种质资源。
　　可溶性单宁是柿果实呈现涩味的主要原因，涩柿果实中可溶性单宁含量较高，需脱涩后才适合食用，而脱涩的过程主要是可溶性单宁转变成不溶性单宁的过程。乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenas，DH）是催化乙醇形成乙醛的关键酶之一，同时也可以催化可溶性单宁与乙醛聚合形成不可溶性单宁，进而达到柿果脱涩的效果。本研究以‘南通小方柿’果实为材料，采用同源克隆和3' Race方法，从‘南通小方柿’中克隆了ADH1基因，并将该基因命名为DkADH1。通过生物信息学分析和表达分析，初步鉴定了该基因的特性和在不同组织中的表达模式，同时构建了该基因的植物表达载体，转入模式植物番茄中，进一步研究了该基因的功能。主要研究结果如下:
　　1.以‘南通小方柿’果实为材料，通过同源克隆扩增出1377bp的ADH1基因，命名为DkADH1。其开放阅读框为1137个核苷酸，编码379个氨基酸。编码蛋白分子质量约为41kD，理论等电点PI为6.08，该编码蛋白无跨膜区，无明显的亲疏水性，它具有ADH基因典型的结构域和功能域。通过构建系统进化树，分析不同物种ADH基因间的进化关系。结果表明:‘南通小方柿’DkADH1基因与番茄、苹果等双子叶植物亲缘性关系较近。
　　2.以‘南通小方柿’不同发育时期果实和不同组织为材料，采用qRT-PCR进行了DkADH1基因及单宁生物合成途径中的相关基因的表达分析，同时测定了不同时期果实的单宁含量。结果表明:‘南通小方柿’在果实生长发育过程中，可溶性单宁含量呈现先升高，至7月12日达到最高值10.932mg/g，以后逐渐下降的趋势，而不溶性单宁含量在整个果实发育后期内则呈现逐渐增加的趋势。研究结果还表明:在‘南通小方柿’果实发育过程中，DkADH1基因表达水平呈现明显升高的趋势，同时单宁生物合成途径中的DkF3'5'H、DkDFR、DkPAL、DkLAR、DkDHD/SDH、DkMYB4等基因表达量则呈现下降趋势，维持在较低表达水平上，推测这些基因的表达可能是受DkADH1基因的影响。在‘南通小方柿’树体的茎、叶、花、叶柄、枝皮、果皮，果肉等不同组织中，DkADH1基因表达量依次顺序是果皮＞叶片＞果肉＞枝皮＞茎＞叶柄＞花，在果皮组织中最高，说明该基因具有组织特异性表达。
　　3.用30％乙醇处理‘南通小方柿’成熟早期果实，在4天后完成脱涩，其果实中可溶性单宁含量迅速下降，与此同时不溶性单宁含量迅速上升。DkADH1基因表达分析显示:随着乙醇处理果实时间的延长，其表达水平也逐渐升高，说明该基因的表达能够促进可溶性单宁向不溶性单宁的快速转化。同时我们对乙醇处理后柿果实中单宁合成途径中的相关基因DkPAL、DkF3'5'H、 DkMYB4在果实中表达量也进行了定量分析，发现这些基因的表达量随着乙醇处理果实时间的延长，表达量呈迅速下降趋势。由此我们推测这些基因的表达可能主要受DkADH1基因的负调控。可见DkADH1基因一方面能够促进柿果实可溶性单宁向不溶性单宁转化，另一方面还可以调控单宁合成途径中相关基因的表达，减缓果实中单宁合成的速度，降低果实可溶性单宁含量。
　　4.构建了DkADH1基因的植物表达载体，通过农杆菌介导法将DkADH1基因成功转入番茄中，通过PCR和RT-PCR进行检测，获得了3个转基因株系。以转基因番茄株系和非转基因对照植株为材料，测定番茄不同组织中单宁含量。结果表明:转基因番茄株系的叶片、花、果实中的单宁含量均显著低于非转基因番茄植株，说明该基因的转入抑制了番茄植物组织中单宁的合成。实验进一步分析了原花色素合成途径中F3'5'H、MYB和PAL基因的表达情况，结果表明DkADH1基因在转基因株系的过量表达，明显抑制了F3'5'H、MYB和PAL基因表达，这可能是转基因株系中各组织单宁含量降低的主要原因。因此我们推测DkADH1基因在南通小方柿果实脱涩过程中具有重要的功能。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 文献综述

1 柿种质资源概况及其分类

2 柿单宁研究进展

2．1 单宁分子结构

2．2 柿果单宁细胞的研究现状

3 柿果脱涩机理的研究概况

3．1 柿单宁生物合成相关基因研究进展

3．2 柿单宁ADH基因研究进展

4 柿树遗传转化研究进展

5 本研究的目的和意义

第二章 南通小方柿DkADH1基因的克隆与生物信息学分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 总RNA的质量检测

2．2 DkADH1基因的克隆

2．3 DkADH1基因的3’RACE扩增

2．4 DkADH1基因的氨基酸序列同源性比对分析

2．5 DkADH1基因的分子进化树

2．6 DkADH1基因蛋白质的理化性质分析

2．7 DkADH1基因氨基酸序列的亲水性／疏水性分析

2．8 DkADH1基因蛋白质跨膜区的分析

2．9 DkADH1基因基因编码蛋白信号肽的预测与分析

2．10 DkADH1基因二级结构的预测与分析

2．11 蛋白质三级结构

3 讨论

第三章 南通小方柿中DkADH1基因及单宁合成相关基因的表达分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 主要试剂和仪器

1．3 方法

2 结果与分析

2．1 南通小方柿果实不同发育时期单宁含量的变化

2．2 乙醇处理对南通小方柿离体果实单宁含量的影响

2．3 DkADH1基因表达分析

2．4 南通小方柿果实发育时期单宁生物合成途径基因的表达分析

2．5 乙醇处理对柿果实单宁生物合成相关基因表达模式的影响

3 讨论

第四章 DkADH1基因植物表达载体的构建及遗传转化研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 DkADH1基因植物表达载体构建和鉴定

2．2 转基因植株的获得

2．3 GUS检测

2．4 转基因株系PCR检测

2．5 RT-PCR检测

2．6 炼苗移栽

2．7 番茄果实发育过程中单宁含量的变化

2．8 转基因番茄中原花色素合成途径基因相关表达分析

3 讨论

全文结论

创新点

参考文献

硕士期间发表文章

致谢