猪三种细胞因子免疫增强作用和山羊四种抗血清抑制细胞因子活性分析

摘要

细胞因子是由机体免疫细胞和免疫相关细胞分泌的一类高活性多功能蛋白质类物质，是细胞间的信号传递分子，调节和介导着体内的免疫应答和炎症反应，是机体免疫学功能发挥的必要成分。IL-2、IL-4、IL-18和IFN-γ都是机体免疫应答不可缺少的成分，因其具有重要的免疫调节作用而成为免疫佐剂研究的热点。本研究对猪重组IL-2、IL-4和IFN-γ进行了诱导表达，进而开展了对口蹄疫合成肽疫苗免疫增强作用的研究，为细胞因子佐剂的临床应用提供了试验依据;又对山羊重组IL-2、IL-4、IL-18和IFN-γ进行了诱导表达，并进行了各重组蛋白的生物学活性检测和相应抗血清抑制蛋白活性的研究。
　　1.猪重组IL-2、IL-4和IFN-γ原核表达和生物学活性检测
　　对含有pET28a-IL-2、pET32a-IL-4和pET28a-IFN-γ重组质粒的Rosetta2阳性克隆菌进行诱导表达，分别表达了相对分子量为21.4kDa、30.3kDa和20.7kDa的重组蛋白，并对包涵体蛋白进行了纯化和复性。通过CCK-8法检测了重组蛋白IL-2和IL-4对猪外周血淋巴细胞的增殖活性，并利用VSV/PK15系统检测了重组蛋白IFN-γ的抗病毒活性。结果显示猪重组蛋白IL-2能显著刺激外周血淋巴的增殖，并表现出一定的剂量依赖性，在蛋白浓度为10μg/mL时刺激效应最强，但当超过10μg/mL时刺激增殖效应开始减弱;重组蛋白IL-4不能有效刺激淋巴细胞的增殖，增殖效应较弱;重组蛋白IFN-γ能有效抑制VSV在PK15细胞上的复制，具有良好的抗病毒作用，其抗VSV活性为1.135×104U/mg。
　　2.猪重组IL-2、IL-4和IFN-γ对口蹄疫合成肤疫苗的免疫增强作用研究
　　分别将原核表达的猪重组IL-2、IL-4和IFN-γ蛋白以15μg/kg剂量与口蹄疫合成肽疫苗配伍免疫仔猪，并设空白对照组(PBS)、口蹄疫疫苗对照组、空载体蛋白对照组，检测仔猪抗口蹄疫抗体水平和血清细胞因子IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ含量的变化，观察其免疫佐剂效应。结果表明:制备的IL-2、IL-4和IFN-γ重组蛋白均有较好的生物学活性，其中IL-2和IFN-γ重组蛋白均能显著提高仔猪抗口蹄疫抗体水平(P＜0.01)，而IL-4重组蛋白抑制口蹄疫抗体的产生(P＜0.01）。血清细胞因子检测结果发现疫苗+IL-4组的IL-4和IL-10含量均较疫苗对照组显著升高(P＜0.05），疫苗+IL-2组及疫苗+IFN-γ组的IFN-γ含量较疫苗对照组极显著升高(P＜0.01)。结果提示，重组细胞因子IL-2和IFN-γ分别作为免疫佐剂与口蹄疫疫苗配伍使用，能显著增强机体的体液和细胞免疫应答。
　　3.山羊重组IL-2、IL-4、IL-18和IFN-γ抗血清抑制重组蛋白活性分析
　　将含pET32a-IL-2、pET32a-IL-4、pET28a-IL-18和pET32a-IFN-γ重组质粒的BL21阳性克隆菌经IPTG诱导表达，分别表达了相对分子量为35.6kDa、30.7kDa、37.3kDa和22.3kDa的重组蛋白，并对表达的包涵体蛋白进行了纯化和复性。利用CCK-8法检测了重组蛋白IL-2、IL-4和IL-18对山羊外周血淋巴细胞的增殖活性，通过巨噬细胞吞噬功能和硝酸还原酶法检测了IL-18对鼠腔来源巨噬细胞吞噬中性红和分泌NO能力的影响，并利用VSV/PK15系统检测了IFN-γ重组蛋白的抗病毒活性，接着进行相应抗血清抑制上述重组蛋白活性的检测。结果表明山羊重组蛋白IL-2、IL-4和IL-18能显著刺激山羊外周血淋巴细胞的增殖，并表现出一定的剂量依赖性，三种重组蛋白分别在5μg/mL、25μg/mL和4μg/mL时刺激效应最强;IL-18对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红和分泌NO能力的影响也与其剂量密切相关，在适宜的浓度范围内随蛋白剂量增加而能力增强，在IL-18浓度为0.25μg/mL时巨噬细胞吞噬中性红能力最强，在IL-18浓度为1μg/mL时分泌NO能力最强。山羊重组IFN-γ具有较好的抗病毒作用，其抗VSV活性为2.52×104U/mg。抗血清封闭试验结果表明相应抗血清能分别抑制上述重组蛋白生物学活性的发挥。

目录

声明

论文说明

摘要

前言

第一章 细胞因子佐剂研究进展

1 细胞因子佐剂的产生

2 细胞因子佐剂的作用机制

3 常见的细胞因子佐剂

4 细胞因子佐剂应用原则

参考文献

第二章 细胞因子IL-2、IL-4、IL-18和IFN-γ研究进展

1 IL-2研究进展

1．1IL-2的发现及命名

1．2IL-2的基因和蛋白结构

1．3 IL-2的受体及信号转导

1．4 IL-2的生物学活性

1．5 IL-2作为免疫佐剂的研究进展

2 IL-4研究进展

2．1 IL-4的发现及命名

2．2 IL-4的基因和蛋白结构

2．3 IL-4的受体及信号转导

2．4 IL-4的生物学活性

2．5 IL-4作为免疫佐剂的研究

3 IL-18研究进展

3．1 IL-18的发现及命名

3．2 IL-18的基因和蛋白结构

3．3 IL-18的受体及信号转导

3．4 IL-18的生物学活性

3．5 IL-18作为免疫佐剂的研究

4 IFN-γ研究进展

4．1 IFN-γ的发现及命名

4．2 IFN-γ的基因和蛋白结构

4．3 IFN-γ的受体及信号转导

4．4 IFN-γ的生物学活性

4．5 IFN-γ作为免疫佐剂的研究

参考文献

第三章 猪重组IL-2、IL-4和IFN-γ原核表达和生物活性分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 重组质粒双酶切鉴定

2．2 细胞因子重组蛋白诱导表达

2．3 细胞因子重组蛋白纯化、复性

2．4 细胞因子重组蛋白生物活性分析

3 讨论

参考文献

第四章 猪重组IL-2、IL-4和IFN-γ对口蹄疫合成肽疫苗的免疫增强作用研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 仔猪血清O型FMDV抗体效价ELISA检测

2．2 仔猪血清细胞因子IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ含量ELISA检测

3 讨论

参考文献

第五章 山羊重组IL-2、IL-4、IL-18和IFN-γ抗血清抑制细胞因子活性分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2方法

2 结果

2．1 山羊细胞因子重组蛋白诱导表达

2．2 山羊细胞因子重组蛋白纯化、复性

2．3 山羊重组细胞因子Western blot分析

2．4 山羊重组细胞因子生物活性分析

2．5 山羊细胞因子重组蛋白抗血清抑制蛋白活性分析

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢