新型荧光实时定量检测新城疫病毒方法的建立及其在鸡肉食品安全控制中的应用

摘要

新城疫是由新城疫病毒引起、侵害对象主要为鸡和火鸡的一种急性、热性、败血性、接触性传染病。因新城疫的普遍存在性，以及四季均可发生的流行性，现已成为危害世界禽类养殖最严重的疾病之一。因此，对新城疫进行流行病学检测，以及对其疑似病例做出快速而准确的诊断，进而掌控新城疫的遗传变异规律，对于保护消费者的生命安全，发展禽类养殖业以及减少经济损失具有非常重要意义。
　　新城疫病毒传统的确诊方法主要依赖病毒的分离鉴定及血清学检测（主要包括鸡胚中和试验、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验等方法），这些方法通常耗时长、灵敏度低且经验依赖性强。
　　在中国，根据新城疫诊断的国家标准要求，新城疫病毒的主要检测方有:临床诊断、血凝试验、血凝抑制试验、致病指数测定、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）五种检测方法。但其中临床诊断法受疑似感染病例的不同而存在较大个体差异，同时检测人员的诊断经验与观察习惯都对诊断结果有很大影响。因此临床诊断只能作为新城疫病毒疑似病例的初步判断。而血凝、血凝抑制和致病指数测定都存在实验操作复杂、实验周期长、假阳性率较高的缺点。反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法是一种快速准确的检测方法，但产物需经琼脂糖凝胶电泳和EB染色等，易产生污染和假阳性。在禽类养殖的迅速发展的当下，需要建立一种快速、准确、高效的检测方法，以及时发现和控制保护消费者食用安全，减少经济损失。
　　本研究所建立针对于新城疫病毒的Taq man一步法QRT-PCR检测方法是在传统RT-PCR检测方法的基础上添加Taq man荧光探针，通过利用荧光定量PCR仪对荧光信号的收集来实现对PCR的全程实时检测，最终结果通过制定标准曲线对未知浓度的模板实行定量解析。通过本研究证明该方法相较于传统方法而言具有更高的灵敏度，特异性和更强的稳定性。本研究还将建立及优化后的检测方法应用于临床样品检测。经过与传统方法的对比检测结果，证明该方法可以用于临床样品的检测。
　　本研究分为两个部分进行研究:
　　新城疫病毒一步法QRT-PCR检测条件优化。将新城疫病毒标准样品通过SPF鸡胚培养法进行培养并提取，在检测其纯度与完整性合格后用作检测模板。通过查阅相关文献，设计一对新城疫病毒的特异性引物与探针，在基础反应体系的上，通过筛选确定四项优化因素:逆转录酶、dNTP、Mg2+、Taq酶，利用正交试验确定每种因素的最优反应条件及个因素之间交互作用，并建立针对新城疫病毒检测的一步法qRT-PCR检测条件。
　　新城疫病毒新型荧光实时定量检测试剂的组装及研制。在第一部分检测方法及各项条件优化的基础上，研制了一种城疫病毒新型荧光QRT-PCR检测试剂盒，对组装的试剂盒进行了各项指标如特异性、稳定性、灵敏度、重复性、保存期等的验证性试验，获得了丰富的试验数据。此外，将符合质量要求的试剂盒应用于实验室的临床样品检测，获得了重要的临床应用数据。这些研究数据都充分证明了本研究所组装的新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒具有快速简便、灵敏度高、特异性强、检测性能稳定等优点，在我国新城疫病毒的检测与检测中具有巨大的应用价值，可推广使用。

目录

声明

摘要

英文缩写词表

第一章 新城疫病毒检测方法的研究进展及应用

1 引言

2 新城疫病原

2．1 新城疫病毒病原学特点

2．2 新城疫病毒流行学特点

3 新城疫的临床症状和诊断

3．1 新城疫与类似病的鉴别诊断

3．2 新城疫的典型和非典型

3．3 病理变化

4 新城疫的实验室诊断技术

4．1 实验室常规检测技术

4．2 分子生物学诊断技术

第二章 新城疫病毒QRT-PCR检测条件优化

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 新城疫病毒QRT-PCR检测条件优化

2．1 新城疫病毒QRT-PCR检测条件正交试验

2．2 四个影响因素交互作用验证

2．3 新城疫病毒QRT-PCR检测条件优化结果

2．4 四个影响因素之间的交互作用结果验证

2．5 新城疫病毒QRT-PCR检测条件优化结果讨论

3 新城疫病毒QRT-PCR检测方法应用测定

3．1 灵敏度实验

3．2 特异性实验

3．3 稳定性试验

3．4 灵敏度实验结果

3．5 特异性实验结果

3．6 稳定性实验结果

4 讨论

第三章 新城疫病毒新型荧光实时定量检测试剂盒的研制及应用

1 材料与方法

1．1 试剂

1．2 耗材

1．3 探针与引物合成

1．4 仪器设备

1．5 病毒

2 新城疫病毒新型荧光实时定量检测试剂制备

2．1 探针与引物的设计与工作液的制备

2．2 阳性对照样品的制备

2．3 阴性对照样品的制备

2．4 QRT-PCR预混液制备

2．5 逆转录酶与Taq DNA聚合酶的制备

2．6 检测试剂盒的组装

3 新型荧光实时定量检测新城疫病毒试剂盒质量验证

3．1 RNA模板标准品制备

3．2 同一实验员不同批次试剂盒重复性试验

3．3 不同实验员相同试剂盒重复性试验

3．4 试剂盒保存期试验

3．5 RNA模板标准品制备结果

3．6 同一实验员不同批次试剂盒重复性试验结果

3．7 不同实验员相同试剂盒的灵敏度重复性试验结果

3．8 试剂盒保存期试验结果

3．9 新型荧光实时定量检测新城疫病毒试剂盒质量验证结果

4 新型荧光实时定量检测新城疫病毒试剂盒的应用

4．1 样品采集与处理

4．2 样品检测

4．3 检测结果

5 讨论

参考文献

附录

致谢