市售凉拌菜致病菌污染分析及PCR快速检测方法建立

摘要

金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽胞杆菌和大肠杆菌O157是五种极易污染食品的微生物，从而导致食源性疾病爆发，引起食品安全问题。因此，这五种食源性微生物对人类的健康、生活造成极大的损失和危害。凉拌菜是一种深受消费者青睐的即食菜肴，它制作简易、价格便宜、食用方便，已经成为消费者餐桌上的常见菜品。然而，目前我国尚未出台有关凉拌菜加工制作的卫生规范，由于凉拌菜储存和销售的卫生情况良莠不齐，而且消费者购买之后可不经加热直接食用，因此，凉拌菜极易被各种食源性致病菌污染。
　　目前，食品安全检测部门仍采用传统的分离鉴定方法来检测致病菌，该方法虽然准确但步骤繁琐且耗时长，在实际爆发疫情时，不能满足检测的需要。聚合酶链式反应(PCR)的检测方法凭借其高效快速、特异性强、灵敏度高的优势，在突发的食品安全事故中，更能满足快速检测病原菌的需要。本文旨在了解市售凉拌菜致病菌污染状况，利用一些新型高特异性靶点建立高效灵敏的PCR快速检测方法，为食源性致病菌安全控制提供依据。取得的主要结果如下:
　　1、市售凉拌莱致病菌污染状况调查从超市、农贸市场、流动摊贩采集市售凉拌菜共计99份，按照国标法进行沙门氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157、蜡样芽孢杆菌检测，同时利用PCR方法同步进行初筛。调查表明，在采集的99份凉拌菜样品中，金黄色葡萄球菌污染较严重，污染率为8.08％，其次是单增李斯特氏菌(6.06％)、沙门氏菌(2.02％)，未检测到蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌O157污染。三类凉拌菜中，肉制品类凉拌菜的致病菌污染率高于蔬菜类、豆制品类。流动摊贩的致病菌污染率显著高于农贸市场、超市。PCR法由于假阳性，初筛检出率高于国标法。
　　2、市售凉拌菜致病菌多重PCR检测方法的建立根据生物信息学方法挖掘得到的新靶点设计三对引物:沙门氏菌SC8、单增李斯特氏菌lm16、金黄色葡萄球菌Sa5，用于多重PCR检测。在单重PCR反应中，针对39株沙门氏菌、17株金黄色葡萄球菌、10株单增李斯特氏菌和20株其余阴性对照菌，对三对引物进行单重PCR特异性验证，三对引物均表现出了较高的特异性。三对引物在单重PCR反应中表现出了较高的灵敏度:SC8为340.3 fg/μL，lm16为10.40 fg/μL，Sa5为173.7 fg/μL。对多重PCR体系中的Mg2+、dNTP Mixture、TaqDNA聚合酶、退火温度、循环次数进行了优化研究，经过优化之后的25μL多重PCR反应体系为:2.5μL10×PCR Buffer、4.0μL MgCl2(25mM)、2μL dNTP Mixture(各2.5mM)、0.5μL Taq酶(5.0U)、6.0μLDNA模板(三种致病菌各2.0μL)，引物(10 umol) lm16、SC8、Sa5分别为0.5μL、1μL、2.6μL，ddH2O补足至25μL。PCR反应程序为:①94℃2 min;②94℃30s;③60℃30s;④72℃90 s;⑤72℃10 min;②～④步重复30次。多重PCR体系具有较好的特异性，在沙门氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌随机组合成的26个DNA组合中扩增出了三条对应的条带。多重PCR细菌纯培养物的灵敏度为103cfu/mL。
　　3、多重PCR反应体系稳定性评价及检测应用在无反复冻融情况下，置于4℃下保存，在40天内多重PCR检测效果较好;置于-20℃、-70℃下保存，在60天内多重PCR检测效果较好。在反复冻融情况下，置于-20℃和-70℃下保存30天的PCR反应体系，受反复冻融的影响要稍小于4℃保存。置于4℃下保存30天的PCR反应体系在冻融10次内扩增时，检测效果稳定。置于-20℃和-70℃下保存30天的PCR反应体系在冻融12次内扩增时，检测效果稳定。随着冻融次数的增加，PCR反应体系的扩增效果越来越差;同一批次重复性试验和不同批次重复性试验表明，相同时间或不同时间组装的PCR反应体系，只要在无菌操作台中规范操作，均可保证其结果的重复性、可靠性;采集50份样品，用于评价多重PCR检测体系。多重PCR用于实际样品检测，检出5株单增李斯特氏菌，2株沙门氏菌，6株金黄色葡萄球菌。国标法用于实际样品检测，检出5株单增李斯特氏菌，2株沙门氏菌，5株金黄色葡萄球菌。由于PCR检测方法的假阳性，比国标法多检出一株金黄色葡萄球菌。其他每份样品的国标法和PCR法检测结果一致。因此，实际检测过程中，可将国标法的标准细菌学检验与PCR检测方法结合起来用，以增加检验结果的准确性和时效性。

目录

声明

摘要

英文缩写

第一章 文献综述

1．凉拌菜简介

2．常见食源性致病菌的生化特性及危害

2．1 沙门氏菌

2．2 金黄色葡萄球菌

2．3 单增李斯特氏菌

2．4 蜡样芽胞杆菌

2．5 大肠杆菌0157∶H7

3．常见食源性致病菌的检测方法

3．1 传统分离培养方法

3．2 PCR技术

4．本研究的主要内容和意义

第二章 市售凉拌菜致病菌污染状况调查

1．材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果与分析

2．1 标准菌株检测结果

2．2 凉拌菜致病菌国标法检测结果

2．3 凉拌菜致病菌PCR检测结果

3．讨论

4．本章小结

第三章 市售凉拌菜致病菌多重PCR检测方法的建立

1．材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果与分析

2．1 单重PCR特异性和灵敏度的测定

2．2 多重PCR反应体系条件优化

2．3 多重PCR特异性和灵敏度的测定

3．讨论

4．本章小结

第四章 多重PCR反应体系稳定性评价及检测应用

1．材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果与分析

2．1 不同保存温度对反应体系的影响

2．2 不同冻融次数对反应体系的影响

2．3 同一批次重复性试验

2．4 不同批次重复性试验

2．5 多重PCR实际样品检测

3．讨论

4．本章小结

参考文献

全文结论

创新点

攻读硕士期间发表论文

致谢