高精料日粮对反刍动物乳腺组织细胞凋亡的影响以及日粮中添加丁酸钠的调节作用

摘要

在现代奶业生产中，为了提高奶产量，同时满足泌乳早期和中期不断增加的能量需求，常给奶牛或奶山羊饲喂高精料，这种饲喂方式会引起瘤胃异常发酵，进而引起亚急性瘤胃酸中毒。瘤胃内LPS蓄积并透过胃肠道到达全身循环系统包括乳腺，LPS可激活NF-κB信号通路，之后调节细胞凋亡。丁酸钠有促进胃肠道组织发育和增强其屏障功能的作用，本试验以泌乳中期荷斯坦奶牛和萨能奶山羊为试验对象，探究高精料日粮对反刍动物乳腺组织细胞凋亡的影响以及日粮中添加丁酸钠的作用。
　　试验一:高精料日粮对奶牛乳腺组织细胞凋亡的影响:本试验以12头泌乳中期的荷斯坦奶牛为试验对象，随机分为两组，每组6只。其中一组饲喂低精料日粮，即日粮中含有40％的精料和60％的粗料，精粗比为4∶6，称为LC组（Low Concentrate），作为对照组;另外一组饲喂高精料日粮，精粗比为6∶4，称为HC组（High Concentrate），作为试验组。试验周期为18周，试验开始前为所有奶牛安装瘤胃瘘管，试验后期采集瘤胃液、奶、乳动脉血、乳静脉血和乳腺组织细胞样品，测定瘤胃液pH值、奶产量和乳成分、瘤胃液和血浆中LPS含量、乳腺组织细胞中凋亡相关基因如caspase-3、caspase-8和caspase-9等的表达以及凋亡相关蛋白酶的活性和通路中NF-κB的蛋白表达。结果显示:长期高精料饲喂使奶牛瘤胃pH值均值降低，pH值低于5.6的时间超过3 h;和低精料组相比，高精料组的奶产量和乳脂率和乳脂含量都极显著下降（P＜0.01），乳蛋白率却显著提高（P＜0.05）;高精料组瘤胃液和血浆中LPS含量都显著高于低精料组(P＜0.01);高精料组caspase-3的基因表达显著高于低精料组(P＜0.05)而bcl-2的基因表达显著低于低精料组(P＜0.05);高精料组caspase-3和caspase-8的酶活性相比于低精料组都显著升高(P＜0.01);高精料组NF-κB p65和磷酸化的NF-κBp65的蛋白表达量都显著高于低精料组(P＜0.05)。结论是长期饲喂高精料诱发了奶牛乳腺组织细胞的凋亡。
　　试验二:高精料日粮对奶山羊乳腺组织细胞凋亡的影响以及日粮中添加丁酸钠的调节作用:本试验采用18头泌乳中期的萨能奶山羊，随机分为三组，每组6只。三组的饲喂方案如下:第一组饲喂低精料日粮，即日粮中含有40％的精料和60％的粗料，精粗比为4∶6，称为LC组（Low Concentrate）;第二组饲喂高精料日粮，精粗比为6∶4，称为HC组（High Concentrate）;第三组饲喂高精料日粮，精粗比为6∶4，并且在日粮中添加丁酸钠（Sodium Butyrate）一同饲喂，称为BHC组。试验周期为20周，试验开始前为所有奶山羊安装瘤胃瘘管和肝脏肝静脉血管插管，试验后期采集瘤胃液、奶、肝静脉血和乳腺组织细胞样品，测定瘤胃液pH值、奶产量和乳成分、血浆中LPS和促炎性因子含量、乳腺组织细胞中凋亡相关基因如caspase-3、caspase-8、caspase-9、bcl-2和bax等的表达以及凋亡相关蛋白酶的活性。结果显示:高精料日粮引起了瘤胃pH的下降，添加丁酸钠后瘤胃pH值有一定回升;HC组外周血中LPS的含量显著高于LC组和BHC组(P＜0.01);HC组外周血中主要炎性因子IL-1β，IL-6，TNF-α的含量都显著高于LC组和BHC组(P＜0.05); HC组caspase-3基因的表达和蛋白酶活性都显著高于LC组和BHC组(P＜0.01)。结论是高精料日粮引起了奶山羊乳腺细胞凋亡，日粮中添加丁酸钠一定程度上缓解了凋亡情况。
　　试验三:高精料日粮对奶山羊乳腺组织细胞凋亡信号通路中相关蛋白表达的影响以及日粮中添加丁酸钠的调节作用:采用18头泌乳中期的萨能奶山羊，随机分为三组，每组6只。三组的饲喂方案如下:第一组饲喂低精料日粮，即日粮中含有40％的精料和60％的粗料，精粗比为4∶6，称为LC组（Low Concentrate）;第二组饲喂高精料日粮，精粗比为6∶4，称为HC组（High Concentrate）;第三组饲喂高精料日粮，精粗比为6∶4，并且在日粮中添加丁酸钠（Sodium Butyrate）一同饲喂，称为BHC组。试验周期为20周，试验后期采集乳腺组织细胞样品。用western blot方法检测通路中相关蛋白如NF-κB、bax、bcl-2、cytochrome C和caspase-3原型和激活型的表达。结果显示:HC组奶山羊乳腺组织细胞中p65的蛋白表达量显著高于LC组和BHC组，并且和LC组相比，BHC组的p65蛋白表达量显著下调;对于磷酸化的p65，HC组含量显著高于LC组和BHC组;BHC组bax的蛋白表达量显著低于LC组和HC组;BHC组的bcl-2蛋白表达量显著高于LC组和HC组;HC组cytochromeC的蛋白含量显著高于LC组和BHC组;对于caspase-3原型，HC组表达量显著高于LC组和BHC组，但是LC组和BHC组之间并无显著差异;对于激活型的caspase-3，BHC组表达量显著低于LC组和HC组。结论是高精料饲喂引起了奶山羊乳腺组织细胞p65和磷酸化的p65表达量的升高，并引起了促凋亡相关蛋白如bax、cytochrome C和caspase-3表达量的升高，而日粮中添加丁酸钠降低了bax、cytochromeC和caspase-3的表达，并且上调了抗凋亡蛋白bcl-2的表达。

目录

声明

摘要

引言

第一章 高精料日粮与亚急性瘤胃酸中毒及LPS的释放

1．2 亚急性瘤胃酸中毒的定义

2 亚急性瘤胃酸中毒发病原因以及机理

2．1 亚急性瘤胃酸中毒的发病原因

2．2 亚急性瘤胃酸中毒的发病机理

3 亚急性瘤胃酸中毒引起的LPS释放

第二章 LPS激活的NF-κB信号通路及其与细胞凋亡的关系

1．2 NF-κB概述

1．3 LPS激活NF-κB的途径

2 细胞凋亡的信号通路

2．1 细胞凋亡相关蛋白家族概述

2．2 细胞凋亡途径

3 NF-κB与细胞凋亡之间的关系

第三章 丁酸钠的生理功能

第四章 高精料日粮对奶牛乳腺组织细胞凋亡的影响

1 材料和方法

1．1 试验设计

1．2 试验动物的饲养和手术

1．3 瘤胃液pH值的测定

1．4 奶产量及乳成分的测定

1．5 瘤胃液以及外周血中LPS含量的测定

1．6 乳腺组织中caspase-3、caspase-8、caspase-9、bcl-2、bax和TNF-α基因相对表达量的测定

1．7 乳腺组织中caspase-3和caspase-8酶活性的检测

1．8 乳腺组织中NF-κB蛋白表达含量的测定

2 数据统计

3 结果与分析

3．1 高精料日粮对奶牛瘤胃液pH值的影响

3．2 高精料日粮对奶牛奶产量与乳成分的影响

3．3 高精料日粮对瘤胃液以及外周血中LPS含量的影响

3．4 高精料日粮对奶牛乳腺组织中caspase-3、caspase-8、caspase-9、bcl-2、bax和TNF-α基因相对表达量的影响

3．5 高精料日粮对奶牛乳腺组织中caspase-3、caspase-8酶活性的影响

3．6 高精料日粮对奶牛乳腺组织中NF-κB蛋白表达的影响

4 讨论

4．1 高精料日粮对奶牛瘤胃液pH值和瘤胃液、外周血中LPS含量的影响

4．2 高精料日粮对奶牛奶产量和乳成分的影响

4．3 高精料日粮对奶牛乳腺组织凋亡的影响

第五章 高精料日粮对奶山羊乳腺组织细胞凋亡的影响以及日粮中添加丁酸钠的调节作用

1 材料和方法

1．1 试验设计

1．2 试验动物的饲养和手术

1．3 瘤胃液pH值的测定

1．4 奶产量及乳成分的测定

1．5 外周血中LPS含量的测定

1．6 外周血中炎性因子的测定

1．7 乳腺组织中caspase-3、caspase-8、caspase-9、bcl-2、bax和TNF-α基因相对表达量的测定

1．8 乳腺组织中caspase-3和caspase-8酶活性的检测

2 数据统计

3 结果与分析

3．1 高精料日粮以及日粮中添加丁酸钠对奶山羊瘤胃液pH值的影响

3．2 高精料日粮以及日粮中添加丁酸钠对奶山羊奶产量和乳成分的影响

3．3 高精料日粮以及日粮中添加丁酸钠对奶山羊外周血中LPS含量的影响

3．4 高精料日粮以及日粮中添加丁酸钠对奶山羊外周血中炎性因子含量的影响

3．5 高精料日粮以及日粮中添加丁酸钠对奶山羊乳腺组织中caspase-3、caspase-8、caspase-9、bcl-2、bax和TNF-α基因相对表达量的影响

3．6 高精料日粮以及日粮中添加丁酸钠对奶山羊乳腺组织中caspase-3、caspase-8酶活性的影响

4 讨论

4．1 高精料日粮以及日粮中添加丁酸钠对奶山羊瘤胃液pH值和奶产量及乳成分的影响

4．2 高精料日粮以及日粮中添加丁酸钠对奶山羊外周血中LPS含量的影响

4．3 高精料日粮以及日粮中添加丁酸钠对奶山羊乳腺组织细胞凋亡的影响

第六章 高精料日粮对奶山羊乳腺组织细胞凋亡信号路中相关蛋白表达的影响以及日粮中添加丁酸钠的调节作用

1 材料和方法

1．1 试验设计

1．2 试验动物的饲养

2 数据统计

3 结果与分析

3．3 高精料日粮以及日粮中添加丁酸钠对奶山羊乳腺组织中bcl-2蛋白表达量的影响

3．4 高精料日粮以及日粮中添加丁酸钠对奶山羊乳腺组织中cytochrome C蛋白表达量的影响

3．5 高精料日粮以及日粮中添加丁酸钠对奶山羊乳腺组织中caspase-3原型蛋白表达量的影响

3．6 高精料日粮以及日粮中添加丁酸钠对奶山羊乳腺组织中激活型caspase-3蛋白表达量的影响

4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

在学期间取得的科研成果