ULTRASTRUCTURAL AND SECRETORY CHARACTERISTICS OF THE REPRODUCTIVE TRACT IN CHINESE SOFT-SHELLED TURTLE,Pelodiscus sinensis

摘要

大部分的爬行动物，生殖系统中具有明显的精子储存现象。在雌性生殖道中，精子储存于输卵管的不同部位，然而在雄性的生殖道中附睾和输出小管是精子储存和运输的位置。爬行动物的输卵管是一个非常重要的生殖器官，具有多种生理学功能。它与卵子的运输和成熟有关，同时也有精子储存的功能。输卵管分泌在鸟类、两栖类、人类和其它的爬行动物中曾有报道。这些分泌在卵子产生和运输、精子获能和精子储存等方面具有不同的机制。中华鳖是我国以及亚洲其它国家的一个古老的爬行动物，也是重要的水产养殖物种，具有极高的经济和药理学价值。因此，探究中华鳖生殖系统的生理学功能，对于养殖业有极大的帮助。关于爬行动物输卵管超微结构及其整合功能机理研究比较少见，而且这些研究仅限于简单的显微检查。本研究中，我们观察了中华鳖生殖道系统的超微结构和分泌的细胞学特性。以精子储存为主线索，我们描绘出了中华鳖输卵管和输出小管的超微结构和分泌的形态学特性。研究结果进一步增加了我们对于中华鳖生殖系统的超微结构、分泌活性和生殖功能的理解。
　　试验Ⅰ中华鳖输卵管分泌的细胞学证据输卵管是受精和精子储存的场所。本实验用光学显微镜和透射电子显微镜观察了中华鳖输卵管峡部、子宫部和阴道部上皮的超微结构以及腺体分泌特性。这些部位的上皮由纤毛细胞、分泌细胞和其它细胞构成;前两类细胞贯穿整个上皮，并且以分泌细胞为主。纤毛细胞以呈现分泌囊泡为特征，它以顶浆分泌的方式释放到管腔中，但是分泌细胞含有典型的深色和浅色的两相颗粒物。第三类的细胞有比较宽的近端部分，大量的线粒体、囊泡和狭窄的细胞核。精子主要存储于输卵管的峡部、子宫部和阴道部。此外，腺细胞呈现明显特征，包括呈现不同形状、大小和电子密度的颗粒物。本实验第一次描述了这些颗粒物的合成。线粒体在这些密集颗粒物的形成中起了重要的作用，粗面内质网和微丝在这些颗粒物的成熟中也起了一定的作用。颗粒成熟之后，腺细胞将这些颗粒物释放到管腔中。
　　试验Ⅱ中华鳖输卵管上皮和腺体的外泌体及其分泌研究输卵管是卵子产生、受精和精子储存的位置，然而它的分泌具有不同的生理功能。本实验中运用免疫组织化学和透射电子显微镜观察了中华鳖输卵管上皮和腺细胞的结构以及其分泌物，尤其是外泌体。上皮的纤毛细胞和腺细胞与外泌体的释放有关，外泌体在整个一年中都可以分泌到管腔中;外泌体直接从上皮释放，或者与多囊泡体有关。这些外泌体也广泛分布于上皮纤毛细胞和腺体管腔边缘。细胞内的多囊泡体内含有不同大小的外泌体。外泌体与管腔中精子的纤毛和细胞膜紧密接触，这表明了它们的膜融合特性。纤毛细胞和腺细胞中外泌体的阳性反应在一月份、九月份和十二月份从强到中等，这个时间点也是精子在中华鳖存储的时期，然而在生殖季节（五月份）阳性反应变得越来越弱。这是第一次在爬行类动物上鉴定外泌体的存在。上皮细胞和腺细胞内和细胞外的外泌体，细胞内的多囊泡体，分泌物和分泌囊泡，以及整个一年中外泌体的释放使得这个爬行物种具有特殊的分泌特征，成为研究输卵管分泌本质的一个潜在的模式动物。
　　试验Ⅲ中华鳖和鸡输卵管、储精小管的超微结构和分泌学特性的比较研究为了比较中华鳖和鸡的超微结构和分泌特性，我们用鸡子宫阴道连接部位以及鳖输卵管峡部作为实验材料。在中华鳖，储精小管主要分布于输卵管的峡部;而在鸡子宫阴道连接部却含有大量的储精小管。子宫阴道连接部和峡部其上皮都是由纤毛细胞和分泌细胞构成。在子宫阴道连接部上皮的纤毛细胞中，细胞核上方的胞质中含有浅的、致密的分泌颗粒。纤毛细胞中致密的分泌颗粒体积较大，有透明的边缘和数层同心圆包裹。子宫阴道连接部的分泌细胞，它可以通过微绒毛以顶浆分泌的方式释放分泌物质。在这些细胞中密集的分泌颗粒体积较小，缺乏边缘和同心圆层，通过分泌囊泡释放到管腔中。鸡子宫阴道连接部的储精小管中，整个上皮中分泌细胞和纤毛细胞都含有密集的浅的颗粒物。与子宫阴道部位上皮相比较，储精小管纤毛细胞中密集的分泌颗粒体积较小，缺乏同心圆和边缘。鸡和鳖的输卵管上皮细胞分布基本保持一致，由纤毛细胞和分泌细胞构成，这些细胞与分泌有关。子宫阴道连接部和峡部的纤毛细胞同样也与管腔中释放外泌体和分泌囊泡有关。子宫阴道连接部的分泌细胞胞核上方的细胞质中观察到了多囊泡体，这与外泌体的生成有关。总体来说，上皮细胞顶端以顶浆分泌的方式释放外泌体，细胞内多囊泡体的鉴定和颗粒物的释放使得上皮细胞具有独特的分泌特性。
　　试验Ⅳ中华鳖输出小管的形态和超微结构研究中华鳖输出小管的比较研究增加在高脊椎动物中对于精子能动性和受精进化的理解。因此在这个研究中，用光学显微镜和透射电子显微镜观察了输出小管的组织学和超微结构特征。输出小管是睾丸之外的起源于睾九网的22-28条小管。上皮主要由两种类型的细胞构成，主要为非纤毛细胞和纤毛细胞。纤毛细胞有很长的一个纤毛，突出到管腔中。这些细胞的细胞核上方具有成簇的线粒体以及被膜小泡、囊泡、细胞内间隙和连接复合体。输出小管近端部分的纤毛细胞细胞质顶端包含具有内陷小窝和小管的内吞装置。这些细胞的核周围呈现大量的交叉结合和脂滴。非纤毛细胞在细胞核上方和胞核边缘的细胞质中有成簇的线粒体，其细胞核很容易染色。进一步观察发现，靠近管腔上皮的轮廓是不规则的。顶端细胞质伸入管腔中形成了细胞质突起。本实验第一次详细的描述了中华鳖输出小管的特征，尤其是纤毛细胞的形态学特征，这些细胞与管腔液的混合物有关，并且将精子转运到了远端。

目录

声明

Contents

摘要

ABSTRACT

List of Abbreviations

Chapter 1 Introduction

1．1 Ultrastructure of oviduct in relation with its secretions

1．2 Ultrastructure of efferent ductules in male reproductive tract

1．3 Research goals

CHAPTER 2 Literature Review

1．1 Introduction to Chinese soft-shelled turtle Pelodiscus sinesis

Part Ⅱ Introduction to Reproductive Tract

2．2 The male reproductive tract of Chinese soft-shelled turtle

Part-Ⅲ Oviduct secretions and Efferent duetules

3．1 Physiological role of oviduct secretions

3．2 Ultrastructure of efferent ductules

References

Chapter 3 (Experiment 1) Novel cellular evidence of oviduct secretions in the Chinese soft-shelled turtle Pelodiscus sinensis

1．Introduction

2．Materials and Methods

2．1 Experimental Animals

2．2 Ethical Approval

2．3 Sample collection and Light Microscopy

2．4 Sperm Staining

2．5 Sample collection and Transmission Electron Microscopy (TEM)

3．Results

3．1 Oviduct ultrastructure

3．2 Ultrastructure of the oviduct epithelium related to secretion Ciliated cells and their secretions

3．3 Ultrastrueture of oviduct glands

4．Discussion

4．1 Ultrastrueture of the oviduct in relation to the unique secretions of epithelial cells

4．2 Glandular secretions

4．3 Sperm storage and oviduct secretions

5．Conclusion

References

Chapter 4 (Experiment 2) Epithelial and glandular evidence of exosomes and secretions in the oviduct of Chinese soft-shelled turtle Pelodiscus sinensis

1．Introduction

2．Material and Methods

2．1 Animals

2．2 Immunohistochemistry

2．3 Transmission Electron Microscopy (TEM)

3．Results

3．1 Immunohistochemistry

3．2 Detection of exosomes through transmission electron microscopy

4．Discussion

References

CHAPTER 5 (Experiment 3) Comparative study of the ultrastructure and secretion of oviduct and SSTs between the turtle and hen

1．Introduction

2．Materials and Methods

2．1 Animal Use

2．2 Samples Collection

2．3 Light microscopy

2．4 Transmission Electron Microscopy

3．3 Ultrastructure of the epithelium in UVJ of hen oviduct

3．4 Ultrastructure of SSTs and its unique secretions of hen

3．5 Comparison of ultrastructure and secretory cytology of hen and turtle

4．Discussion

5．Conclusion

References

Chapter 6 (Experiment 4) Morphological and ultrastruetural study of the efferent ductules in the Chinese soft shelled turtle Pelodiscus sinensis

1．Introduction

2．Materials and Methods

2．1 Experimental animals

2．2 Light Microscopy

2．3 Transmission Electron Microscopy (TEM)

3．Results

3．1 Light microscopic observations

3．2 Electron microscopy observations

4．Discussion

5．Conclusion

References

Summary

Conclusion

Innovations

Future Research Directions

Publications

ACKNOWLEDGEMENTS