共生菌Wolbachia与寄主互作对二斑叶螨胞质不亲和(CI)的影响

摘要

Wolbachia是广泛存在于节肢动物和丝线虫体内的呈母系遗传的一类胞内共生菌。它能够以多种方式调控宿主的生殖行为，引发宿主生殖异常。这些调控手段主要包括诱导胞质不亲和(cytoplasmic incompatibility，CI)、孤雌生殖(parthenogenesis)、雌性化(feminization)和杀雄(male-killing)。在这些调控方式中，CI是最为普遍的表型，但其中潜在的分子机理至今仍没有得到明确的解释。二斑叶螨Tetranychusurticae Koch在分类学上属于蛛形纲蜱螨亚纲真螨目叶螨科叶螨属，是一种重要的农业害螨，其在自然条件下感染Wolbachia。检测Wolbachia能否影响二斑叶螨的生殖，了解这种影响下潜在的分子机制，以及进一步应用Wolbachia作为生防手段控制二斑叶螨种群的暴发，在农业生产上意义重大。锚蛋白重复序列(ANK)通常含有33个残基，已经在大量的蛋白质被鉴定并发现。ANK蛋白能介导蛋白质之间的相互作用，研究表明，ANK可能与CI产生的分子机制相关。
　　本文以中国二斑叶螨云南种群(YN)、呼和浩特种群(HU)和福建种群(FJ)为实验材料，检测了Wolbachia对二斑叶螨云南种群（YN）、呼和浩特种群(HU)和福建种群(FJ)生殖的影响。
　　结果表明，Wolbachia能够诱导云南种群(YN)强CI，呼和浩特种群(HU)中等强度的CI、福建种群(FJ)弱CI。这种不同强度的CI也存在于种群间的杂交中以及回交实验得到的叶螨株系进行的杂交中:在含有FJ核背景的雄性杂交中CI较弱，含有YN核背景的雄性杂交中CI较强。对三个地理种群的二斑叶螨体内Wolbachia株系的wsp基因和一系列持家基因、叶螨的COI基因和ITS区段进行序列测定。测序结果表明，三个地理种群中感染的Wolbachia的wsp基因和持家基因序列一致，为同一株系;而叶螨的COI基因序列存在差异，表明二斑叶螨两地理种群的遗传背景存在一定差异。本次研究明确了Wolbachia能够对二斑叶螨的生殖产生调控，并且CI的诱导会受到宿主核遗传背景的影响。
　　另外我们研究了雄螨日龄、Wolbachia密度对Wolbachia诱导我国二斑叶螨种群 CI的影响。研究的结果表明雄螨的日龄、Wolbachia密度对Wolbachia诱导我国二斑叶螨种群CI没有影响。
　　为了弄清ANK基因和CI之间的关系，我们在云南（YN）、呼和浩特(HU)、福建(FJ)中国三个具有不同CI程度的二斑叶螨种群中鉴别了wMel中的ANK同源基因，wMel是可以导致果蝇CI的株系。同时还对不同日龄雌雄成虫中ANK基因表达进行定量，了解ANK在寄主中的表达情况。通过对具有不同程度CI的二斑叶螨种群雄虫的ANK定量比较分析显示ANK在雄虫中的表达量与CI程度呈正相关。
　　我们的结果描述了新型的Wolbachia与寄主互作关系，以及这种互作对CI的影响，并且为ANK基因与寄主的互作可能是CI的分子机制的关键步骤的推测提供了证据。此外，对Wolbachia锚蛋白基因的产物的功能研究，尤其是关于其对生殖方面的功能研究也是非常必要的。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 Wolbachia的研究进展

1．1 Wolbachia的生物学特性

1．2 Wolbachia的系统进化

1．3 Wolbachia的传播方式

1．4 Wolbachia对宿主生殖的调控作用

1．5 Wolbachia对宿主的其他影响

1．6 Wolbachia应用展望

2 锚蛋白重复序列(ANK)

2．1 ANK的结构特征

2．2 ANK结构域的功能

2．3 含有ANK基因的Wolbachia

2．3 ANK的研究展望

3 我国二斑叶螨的发生和危害

第二章 Wolbachia对不同种群二斑叶螨CI的影响

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 二斑叶螨总DNA的提取

1．3 PCR检测二斑叶螨体内的共生菌Wolbachia

1．4 检测二斑叶螨实验种群中的其他共生菌

1．5 二斑叶螨两地理种群COI、ITS及wsp序列的扩增

1．6 二斑叶螨体内Wolbachia的五个持家基因的扩增

1．7 筛选100％感染和100％不感染Wolbachia的品系

1．8 遗传杂交实验

1．9 数据分析

2 结果

2．1 二斑叶螨种群中其他共生菌的检测

2．2 Wolbachia对二斑叶螨种群CI的影响

2．3 二斑叶螨地理种群wsp、COI及ITS基因序列分析

3 讨论

第三章 影响Wolbachia诱导CI表达的因素

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 二斑叶螨总DNA的提取

1．6 质粒的提取

1．7 筛选100％感染和100％不感染的品系

1．8 雄螨日龄对CI的影响

1．9 数据处理

1．10 实时定量PCR检测叶螨体内Wolbachia的相对密度

2 结果

2．1 雄虫日龄对CI的影响

2．2 标准曲线的制定

2．3 二斑叶螨未交配雄虫体内Wolbachia的密度

3 讨论

第四章 ANK基因的分布及表达对CI的影响

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 叶螨总DNA的提取

1．3 灰飞虱总DNA的提取

1．5 PCR产物纯化

1．6 质粒载体的连接反应和转化

1．7 测序

1．8 质粒的提取

1．9 ANK基因识别和引物设计

1．10 RNA的提取及其质量检测

1．11 实时荧光定量PCR检测

2 结果

2．1 ANK基因的分布情况

2．2 总RNA质量检测结果

2．3 ANK的RT-PCR结果

2．4 二斑叶螨体内ANK基因的表达与CI的关系

2．5 灰飞虱体内ANK基因的表达

3 讨论

全文总结

参考文献

附录

学术论文发表情况

致谢