苦丁茶二咖啡酰奎尼酸与肠道微生物的相互作用

摘要

苦丁茶主要由冬青科(Aquifoliaceae)冬青属(Ilex)植物苦丁茶冬青(I.kudingcha C.J.Tseng)和大叶冬青(I.latifolia Thunb)制得，是中国重要别样茶饮料，具有悠久的饮用历史和多种生物活性。苦丁茶含有三萜皂苷、多糖和多酚等多种活性成分，其中苦丁茶多酚主要是咖啡酰奎尼酸(Caffeoylquinic acids，CQAs)类化合物。苦丁茶CQAs包括单咖啡酰奎尼酸(mono-CQAs)和二咖啡酰奎尼酸(diCQAs)等。由于苦丁茶中diCQAs含量很高，并且相比mono-CQAs，关于diCQAs的研究比较少，因此，本文选择苦丁茶diCQAs作为研究对象。膳食多酚具有抗氧化、抗炎症、降脂减肥等多种活性，引起研究者的广泛关注。但是由于其分子量大和多羟基等化学结构特性，多酚的生物利用率很低。膳食多酚在上消化道中变化很少，大部分以固有形式进入结肠，与栖息其中的大量的肠道微生物发生相互作用。肠道微生物具有巨大的代谢潜力，也与宿主健康密切相关。膳食多酚和肠道菌群能够发生双向的作用，多酚能够影响肠道微生物菌群结构和代谢通路，微生物能够代谢多酚转化为代谢产物，增加其生物利用率。因此，膳食多酚可能是通过影响肠道微生物来发挥其生物活性的。本课题以冬青苦丁茶为原料，分离纯化三种diCQA化合物，在明确它们在消化道中的变化的基础上，研究其与肠道微生物的相互作用，对阐述苦丁茶diCQAs的生物活性和作用机制具有重要意义。主要研究内容及结果如下: 1、苦丁茶三种diCQA化合物单体的分离纯化 本节采用柱层析-高速逆流色谱(HSCCC)联用手段纯化苦丁茶的diCQAs化合物。采用热水浸提并冷冻干燥，得到苦丁茶水溶性成分;利用HP-20大孔树脂吸附苦丁茶水溶性组分，经过纯水洗脱后，收集70％乙醇洗脱组分，得到苦丁茶diCQAs混合物;采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.1％盐酸溶剂体系，通过HSCCC分离得到3，4-diCQA以及3，5-和4，5-diCQAs的混合物;最后，通过Toyopearl HW-40S凝胶层析得到3，5-和4，5-diCQA化合物。分离得到的3，4-、3，5-和4，5-diCQA的纯度分别达到94.8％、84.6％和87.3％。 2、苦丁茶diCQAs的体外模拟消化过程 本节采用体外模拟消化体系，研究了苦丁茶diCQAs在口腔、胃、小肠和大肠中的水解和变化情况，并采用Caco-2细胞模型检测了diCQAs及其肠道代谢产物的抗炎症活性。结果表明，苦丁茶diCQAs在人工唾液、胃液和胰液中保持稳定，不会被消化酶水解，Caco-2单层细胞模拟的肠壁细胞也不能水解diCQAs;在体外粪样厌氧发酵模拟的肠道微生物代谢过程中，diCQAs能被水解成mono-CQAs和游离咖啡酸(CA)，进一步代谢产物二氢咖啡酸(DHCA)也能够被检测到，且diCQAs的水解程度与培养体系的碳源和微生物组成相关。苦丁茶三种diCQA化合物以及其肠道代谢产物三种mono-CQAs、CA和DHCA都能够降低脂多糖(LPS)诱导的Caco-2细胞的IL-8的产量。 3、苦丁茶diCQAs在体外对肠道微生物的影响 本节采用体外厌氧发酵模型和高通量测序技术研究了多种碳源培养条件下苦丁茶diCQAs对肠道微生物的影响。结果表明，diCQAs的添加能够提高微生物的多样性;相比不同的碳源，是否添加diCQAs对微生物菌群结构的影响更大;diCQAs能够提高Bacteroides、Escherichia/Shigella、Bifidobacterium、Parasutterella、Alistipes、Romboutsia、Oscillibacter、Veillonella、Butyricimonas、Phascolarctobacterium、Lachnospiracea incertae sedis、Gemmiger、Streptococcus、Clostridium sensu stricto和Haemophilus属的丰度，减少Ruminococcus、Anaerostipes、Dialister、Megasphaera、Megamonas和Prevotella等属;diCQAs还会影响pH和短链脂肪酸的产量，能够提高乙酸和乳酸的含量，减少丙酸和丁酸的生成。总体来看，苦丁茶diCQAs具有一定的肠道微生态调节功能。 4、肠道来源的苦丁茶diCQAs水解菌株和酶的初步研究 本节从人体粪便中分离了一株肠道来源的具有水解苦丁茶diCQAs活性的乳杆菌Lactobacillus sp.M-B。Lactobacillus sp.M-B在利用葡萄糖生长时，不能水解diCQAs;能够水解3，4-diCQA和少量4，5-diCQA，几乎不能水解3，5-diCQA。Lactobacillus sp.M-B能够表达一种位于细胞内的CQAs水解酶，通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换和Sephadex G-100分子筛凝胶层析手段纯化该水解酶。目标CQAs水解酶的分子量大约为50kDa，能够水解diCQAs各个位置上的咖啡酰基生成对应的mono-CQAs，也可以将mono-CQAs水解成CA，最适宜的反应温度和pH分别是37℃和6.5。Mg2+可以激活该CQAs水解酶的活性，可能是其辅酶;Mn2+和EDTA，能够抑制其活性，尤其是EDTA的抑制率可达90％。 5、苦丁茶diCQAs在体内调节脂代谢、炎症和肠道菌群的活性 本节采用C57BL/6J小鼠模型，研究了苦丁茶diCQAs对高脂膳食饲养小鼠的脂代谢、炎症和肠道菌群结构的影响。结果表明，苦丁茶diCQAs能够减少小鼠肝脏、附睾脂肪和肾周脂肪的质量，降低血清中总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL-C)的浓度;能够降低肝脏中脂肪合成和积累相关基因(FAS、SREBP-1c、PPARγ和LXRα)的表达，促进脂代谢相关基因(CPT-1和PPARα)的表达，具有一定的减脂的作用;能够降低血清中炎症因子和内毒素脂多糖(LPS)的水平，减少肝脏中炎症因子的转录水平的表达，具有一定的抗炎症活性。苦丁茶diCQAs能够调节肠道微生物的多样性和菌群的整体结构，虽然不能调节Firmicutes和Bacteroidetes的丰度及其比值，但是diCQAs能够提高高脂膳食小鼠的Akkermansia、Bifidobacterium等属的相对丰度，降低Bilophila、Olsenella等属的丰度，并且肠道菌群的变化与脂代谢具有相关性。综合来看，苦丁茶diCQAs可能通过调节肠道菌群结构，特别是提高Akkermansia的丰度，来降低宿主机体的脂肪积累和炎症水平，但具体的准确机制还需要进一步研究。

目录

声明

摘要

缩略语说明

第一章绪论

1．1膳食多酚概述

1．1．1多酚的结构与分类

1．1．2多酚的活性与机制

1．1．3膳食多酚的消化、吸收和代谢过程

1．2膳食多酚与肠道微生物的相互作用关系

1．2．1肠道微生物对多酚的代谢转化

1．2．2多酚对肠道微生物的影响

1．3苦丁茶概述及苦丁茶多酚

1．3．1苦丁茶分类

1．3．2冬青苦丁茶活性及其活性成分

1．3．3苦丁茶咖啡酰奎尼酸

1．4立论依据及主要研究内容

参考文献

第二章苦丁茶二咖啡酰奎尼酸的分离和纯化

2．1材料与方法

2．1．1材料与试剂

2．1．2仪器与设备

2．1．3 DiCQAs组分制备

2．1．5 DiCQAs的高效液相色谱分析

2．1．6分配系数的测定和计算

2．1．7高速逆流色谱分离diCQAs单体化合物

2．2．2高速逆流色谱分离3，4-diCQA

2．2．3 Toyopearl HW-40S凝胶色谱分离3，5-diCQA和4，5-diCQA

2．3本草小结

参考文献

第三章苦丁茶二咖啡酰奎尼酸的体外模拟消化以及消化产物的抗炎活性

3．1试验材料与方法

3．1．1材料与试剂

3．1．2仪器和设备

3．1．3 DiCQAs组分制备和含量测定

3．1．4模拟唾液消化

3．1．5模拟胃液消化

3．1．6模拟胰液消化

3．1．7模拟肠壁细胞消化

3．1．8模拟肠道微生物消化

3．1．9 DiCQAs及其代谢产物的高效液相色谱分析(HPLC)

3．1．10 DiCQAs及其代谢产物的抗炎症活性

3．1．11数据处理

3．2结果与讨论

3．2．1 DiCQAs在模拟唾液、胃液和胰液消化中的稳定性

3．2．2 Caco-2细胞对diCQAs的代谢

3．2．3肠道微生物对diCQAs的水解和代谢作用

3．2．4 DiCQAs及其代谢产物的抗炎症活性

3．3本章小结

参考文献

第四章苦丁茶二咖啡酰奎尼酸在体外厌氧发酵中对肠道菌群的影响

4．1试验材料与方法

4．1．1材料与试剂

4．1．2仪器和设备

4．1．3 DiCOAs组分制备

4．1．4体外厌氧发酵培养

4．1．5 pH测量

4．1．6短链脂肪酸测定

4．1．7体外厌氧发酵体系中微生物群落结构分析

4．1．8统计分析

4．2结果与讨论

4．2．1 DiCQAs对肠道微生物菌群丰富度和α多样性的影响

4．2．2体外发酵微生物菌群的组间总体差异

4．2．3 DiCQAs对肠道微生物菌群的组成的影响

4．2．4 DiCQAs对体外厌氧发酵体系pH的影响

4．2．5 DiCQAs对肠道微生物短链脂肪酸产量的影响

4．3本章小结

参考文献

第五章肠道来源的苦丁茶二咖啡酰奎尼酸水解菌株和酶的初步研究

5．1试验材料与方法

5．1．1材料与试剂

5．1．2仪器与设备

5．1．3高效液相色谱法分析diCQAs及其代谢产物

5．1．4 DiCQAs降解菌株的筛选

5．1．6不同碳源对菌株降解diCQAs的影响

5．1．7 DiCQAs水解酶的分离纯化

5．1．8 DiCQAs水解酶的酶学性质

5．1．9数据统计

5．2结果与讨论

5．2．1 DiCQAs降解菌株的筛选与鉴定

5．2．2不同碳源对Lactobacillus sp-M-B水解diCQAs的影响

5．2．3 Lactobacillus sp-M-B表达的diCQAs水解酶的分离纯化

5．2．4 Lactobacillus sp-M-B表达的diCQAs水解酶的酶学性质

5．3本苹小结

参考文献

第六章苦丁茶二咖啡酰奎尼酸对小鼠肠道菌群、脂代谢和炎症水平的影响

6．1材料与方法

6．1．1材料与试剂

6．1．2仪器与设备

6．1．3小鼠动物实验过程

6．1．4血清中生化指标测定

6．1．5小鼠粪便中肠道微生物菌群结构的高通量测序

6．1．6肝脏中脂代谢和炎症相关基因转录水平表达的测定

6．1．7数据处理、分析与统计

6．2结果与讨论

6．2．1小鼠体重、肝脏和脂肪组织的重量

6．2．2血清中生理和生化指标

6．2．3小鼠肝脏中脂代谢和炎症相关基因在mRNA水平的表达

6．2．4小鼠肠道菌群丰富度和多样性的变化

6．2．5苦丁茶diCQAs对小鼠肠道菌群结构的整体影响

6．2．6苦丁茶diCQAs对小鼠肠道微生物群落组成的影响

6．2．7苦丁茶diCQAs造成的小鼠肠道菌群的差异

6．2．8肠道微生物与宿主代谢的联系

6．3本章小结

参考文献

全文小结

1全文小结

2展望

论文创新点

致谢

攻读学位期间发表的论文和申请的专利