孕酮和雌二醇对猪粪细菌区系的影响

摘要

为了探讨雌性类固醇激素孕酮(Progesterone，P4)扣雌二醇(Estradiol，E2)与肠道菌群的互作机制，本论文比较分析了梅山母猪妊娠30d和妊娠90d粪便中的类固醇激素(P4、E2)、细菌区系及代谢物的变化，同时通过体外厌氧培养的方法，进一步分析P4和E2对粪便菌群的影响。 1.梅山母猪妊娠期类固醇激素、细菌区系和代谢物的变化 梅山母猪妊娠30d粪样中P4和E2的浓度均极显著低于妊娠90d(P＜0.01)。Illumina PE250测序目水平上分析结果表明，妊娠30d粪样中的Burkholderiale和Selenomonadales相对丰度显著低于妊娠90d(P＜0.05)。属水平上分析结果表明妊娠30d的Lachnospiraceae UCG-007、Pseudomonas的相对丰度显著高于妊娠90a(P＜0.05)，而Anaerotruncus、Candidatus Soleaferrea、Phascolarctobacterium、Prevotellaceae UCG-004、Intestinibacter、[Eubacterium]coprostanoligenes group相对丰度显著低于妊娠90d(P＜0.05)。但妊娠30d和90d的细菌区系丰度指数（Ace和Chao）、多样性指数（Shannon和Simpson）均无显著性差异。粪代谢组学分析结果显示，妊娠30d到妊娠90d母猪粪便中有11种代谢物的含量有显著差异(P＜0.01)，主要涉及氨基酸代谢途径（1个）、脂类代谢途径（6个）、碳水化合物代谢途径（3个）及维生素代谢途径（1个）。说明，随着粪便中P4和E2浓度的升高，粪便细菌区系结构也发生变化。 2.孕酮与猪粪细菌区系的互作关系研究 为了分析P4与肠道细菌区系的互作机制，本试验用不同浓度梯度(0.2、2、4、8μg/mL)P4进行猪粪菌群体外37℃厌氧培养，同时设空白对照组(ControlⅠ)和与各处理组等量的二甲亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)对照组（对照组Ⅱ，ControlⅡ），培养8h后，对照组Ⅰ和对照组Ⅱ培养液短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)含量及总菌数量无显著差异，说明每87mL培养体系中含有的27.84μL DMSO对粪便微生物区系没有产生影响。 0.2～8μg/mL P4处理组OD630均显著高于ControlⅡ组（P＜0.05），其中2μg/mLP4组显著高于其它各组（P＜0.05）。q-PCR结果显示，0.2～8μg/mL P4处理组总菌数均极显著高于ControlⅡ组(P＜0.01)，其中2μg/mL P4组极显著高于其它各组（P＜0.01）。说明，P4有促进细菌增殖的作用。 2μg/mL P4组乙酸、异丁酸、异戊酸、戊酸及总酸的含量显著高于ControlⅡ组(P＜0.01)，但其中丙酸、丁酸含量显著低于ControlⅡ组(P＜0.05)。说明，2μg/mL P4影响细菌区系的代谢类型。 Illumina Miseq PE250高通量测序结果表明，2μg/mL P4处理组OTUs、Ace、Chao与ControlⅡ组相比无显著差异。2μg/mL P4处理组的Shannon值极显著高于ControlⅡ组，而Simpson值极显著低于ControlⅡ组（P＜0.01）。门水平上分析结果表明，2μg/mL P4处理组Firmicutes相对丰度极显著低于ControlⅡ组（P＜0.01），Proteobacteria相对丰度极显著高于ControlⅡ组（P＜0.01）。属水平上分析结果表明，2μg/mL P4组Enterobacter、Escherichia-Shigella极显著高于ControlⅡ组（P＜0.01）。而Achromobacter、Enterococcus、Pseudomonas、Ruminococcaceae UCG-005和Streptococcus显著低于ControlⅡ组（P＜0.05）。说明2μg/mL P4处理影响了粪便细菌区系的结构。 P4在培养液中消减率由高到低依次为2、4、8、0.2μg/mL P4组，其中2μg/mLP4组显著高于其它各组（P＜0.05）。4μg/mL P4组极显著高于0.2、8μg/mL P4组（P＜0.01）。0.2μg/mL P4组与8μg/mL P4组相比差异不显著。说明细菌对P4的利用和分解呈剂量依赖型。 3.雌二醇与猪粪细菌区系的互作关系研究 为了分析E2与肠道细菌区系的互作机制，本试验用不同浓度梯度的E2(20、40、60、120ng/mL)进行猪粪菌群体外37℃厌氧培养，同时设空白对照组（对照组Ⅰ，ControlⅠ）和与各处理组等量DMSO的对照组（对照组Ⅱ，ControlⅡ）分别进行体外37℃厌氧培养猪粪菌群，经8h培养后，对照组Ⅰ和对照组Ⅱ培养液SCFAs含量及总菌含量无显著差异，说明每87mL的培养体系中含有的0.42μL DMSO对粪便微生物区系没有产生影响。 40、60、120ng/mL E2组OD630均显著低于ControlⅡ组(P≤0.05)，其中120ng/mL E2组OD630极显著低于其他各组(P＜0.01)。q-PCR结果显示，60、120ng/mLE2组总菌数均极显著低于ControlⅡ组(P＜0.01)，其中120ng/mL E2组极显著低于其它各组(P＜0.01)。说明，E2可抑制粪便中细菌的增殖，且抑制作用随着E2剂量的增加而增加。 120ng/mL E2组乙酸、丁酸、异丁酸及总酸的含量极显著低于ControlⅡ组（P＜0.01）;异戊酸含量极显著高于ControlⅡ组(P＜0.01);但两组间丙酸及戊酸含量差异不显著。说明，120ng/mL E2影响细菌区系的代谢类型。 E2在培养液中消减率由高到低依次为120、20、60ng/mL E2组，其中120ng/mL E2组极显著高于其它各组(P＜0.01);20ng/mL E2组与60ng/mL E2组之间差异不显著。说明细菌对E2的利用和分解存剂量性差异。 Illumina Miseq PE250高通量测序结果表明，120ng/mL E2处理组OTUs显著低于ControlⅡ组（P＜0.05），但两组间Ace、Chao、Shannon和Simpson差异不显著。门水平上的分析结果表明，120ng/mL E2组Bacteroidetes相对丰度极显著低于ControlⅡ组（P＜0.01）;Proteobacteria相对丰度极显著高于ControlⅡ组（P＜0.01）。属水平上的分析结果表明，120ng/mL E2组Enterococcus、Macellibacteroides、Enterobacteriaceae_Unclassified和Kluyvera显著高于ControlⅡ组（P＜0.05），而Bacteroides极显著低于ControlⅡ组（P＜0.01）。提示，120ng/mL E2处理影响了粪便细菌区系的结构。 总结:(1)母猪妊娠期后期粪便中的P4、E2含量显著高于妊娠前期，且细菌区系的结构和代谢产物存在明显差异;(2)雌性类固醇激素影响粪便细菌区系的结构和多样性，且这种作用因激素种类和剂量而异。 创新点:本研究通过结合体内和体外培养的方法，首次揭示雌性类固醇激素(P4、E2)可影响粪便细菌区系的结构和多样性，且这种影响因激素的种类和剂量而异。

目录

声明

摘要

本文部分英文缩略语中英对照

引言

第一章卵巢类固醇激素的合成和调节

2．2合成途径及关键酶

3卵巢P4和E2分泌的调节

第二章雌性类固醇激素与肠道微生物的互作

1肠道微生物的概述

2．1性类固醇激素对肠道微生物的影响

2．2肠道微生物对性类固醇激素的影响

2．3妊娠期间雌性类固醇激素和肠道微生物的变化

第三章梅山母猪妊娠期性类固醇激素和粪细菌区系的变化

1材料与方法

1．1试验设计

1．2样品采集

1．3粪便激素的提取

1．4粪便激素的测定

1．5高通量测序检测粪便细菌区系

1．6 LC-MS代谢组学分析

1．7数据分析

2结果与分析

2．1梅山母猪妊娠期粪生殖激素的变化

2．2梅山母猪妊娠期粪细菌区系的变化

2．3梅山母猪妊娠期粪样代谢物的变化

3讨论

3．1梅山母猪妊娠期粪样中类固醇激素的变化

3．2梅山母猪妊娠期粪样细菌区系的变化

3．3梅山母猪妊娠期粪样代谢组学的变化

第四章孕酮与猪粪细菌区系的互作关系研究

1材料与方法

1．1试验设计

1．2 P4工作液和培养基的制备

1．3接种物的准备及培养

1．4样品采集

1．5测定指标与方法

1．6数据分析

2结果与分析

2．1 P4对细菌区系的影响

2．2细菌区系对P4消减率的影响

3讨论

第五章雌二醇与猪粪细菌区系的互作关系研究

1．1试验设计

1．2母液和溶液的制备

1．3接种物的准备及培养

1．4样品采集

1．5测定指标与方法

1．6数据分析

2结果与分析

2．1 E2对细菌区系的影响

2．2细菌区系对E2消减率的影响

3讨论

全文结论

论文创新点

参考文献

硕士期间发表文章情况

致谢