黄鳝体表粘液中DNA提取方法的建立及相关蛋白和importinα3的表达分析

摘要

本研究从黄鳝体表粘液中提取到基因组DNA，建立了无损伤提取DNA的方法。随后也从体表粘液中提取到了黄鳝的RNA，并通过cDN A-SRAP分子标记技术对黄鳝雌雄粘液进行基因差异表达分析，筛选黄鳝体表粘液中性别相关的分子标记。最后又对从粘液中得到的importinα3基因的部分片段进行了分子克隆和表达分析，为黄鳝抵抗应激环境时在基因水平上的表达模式提供了借鉴，也为importinα基因家族在不同物种上的系统进化发育提供了相关的理论基础。 第一部分黄鳝基因组DNA一般采用抽血或剪取肌肉来提取，但是采血或剪取肌肉后黄鳝成活率很低。为了保留亲本，本研究尝试从黄鳝体表粘液中提取DNA，并采用紫外分光光度计对提取到的DNA的纯度和浓度进行了检测。结果表明，用蛋白酶K消化，酚仿抽提后从粘液中得到的DNA的纯度与从肌肉中提取到的相差不大，但是提取到的量较少。为了验证提取的DNA是不是黄鳝基因组DNA，我们用黄鳝actin引物和18S rRNA基因引物扩增之后检测到了粘液中的较亮的DNA片段。为了进一步确认检测到的是黄鳝的DNA，我们又对得到的DNA进行了扩增，并得到的产物进行了克隆和测序。结果表明，粘液中提取到的DNA是黄鳝的基因组DNA。随后我们又选择了60尾黄鳝，提取其粘液之后对其成活率进行统计，养殖1个月后黄鳝的成活率都在95％以上。此黄鳝体表粘液提取DNA方法能提取高质量的DNA，可用于用于PCR鉴定。 第二部分采用cDN A-SRAP技术对黄鳝雌雄粘液进行基因差异表达分析，筛选黄鳝体表粘液中与性别相关的分子标记。从64对引物组合中筛选出12对引物组合，共获得123个稳定清晰的扩增位点，并筛选出4条雌雄有差异的条带。这4条特异性条带经过回收、克隆、测序后，将测序结果进行Blast分析，结果发现在GenBank中只有片段1与白鳍豚硫酸盐/硫代硫酸盐CYSA样进口ATP结合盒蛋白有较高的同源性。根据片段1的序列设计1对引物进行半定量RT-PCR反应和荧光定量分析，结果发现，片段1在雌雄黄鳝体表粘液均可获得扩增条带，但其在雄性粘液中的表达量显著高于雌性。这可能是由于雌雄黄鳝粘液中所存在的表皮细胞和粘液腺细胞有差异导致的。 第三部分importinα3属于α-输入蛋白家族中的一员，在蛋白分子的入核递送过程发挥着重要的作用。本次研究克隆了黄鳝importinα3基因的c DNA全长序列，对其编码蛋白的结构和遗传进化进行了分析，并对雌雄各组织、胚胎及早期发育阶段进行了表达水平分析。结果表明，黄鳝importinα3基因的c DNA全长3910bp，开放阅读框(ORF)1563bp，编码520个氨基酸，5'非编码区(5'-UTR)166bp，3'非编码区(3'-UTR)2181bp。同源性分析结果显示，黄鳝与其它脊椎动物的importinα3氨基酸序列相似性非常高，都在90％以上，其中与尼罗罗非鱼、南极鳕、大黄鱼的importinα3氨基酸的同源性最高(99％)，与非洲爪蟾importinα3氨基酸的同源性最低(92％)。分子进化聚类分析结果显示，黄鳝与尼罗罗非鱼、南极鳕、半滑舌鳎、青鳉、大黄鱼合为一个小的分支，显示它们亲缘关系较近，随后与其它鱼类形成一大分支。荧光定量PCR结果显示，importinα3基因在雌雄的各个组织中均有表达，其中在雌雄的血液中的表达量差异较大，、小肠、脑中次之。在胚胎发育阶段，卵裂期和原肠胚期的相对表达量较高，而囊胚期以及出膜时期的表达量较低;在出膜之后，importinα3基因的表达量开始有上升趋势，其中卵黄囊吸收完成期的表达量显著高于水平游动期。目前，国内外关于importinα3的研究报道十分有限，本次研究为进一步深入阐述该基因的结构和遗传特性奠定了基础，同时也为黄鳝抵抗应激环境时在基因水平上的表达模式提供了重要借鉴。

目录

声明

摘要

绪论

第一章文献综述

1引言

2鱼类体表粘液的研究进展

2．1体表粘液细胞的组织形态学

2．2体表粘液细胞的分布

2．3影响鱼类体表粘液分泌的因素

2．4鱼类体表粘液的化学成分及活性物质

2．5鱼类体表粘液的功能

3鱼类基因组DNA取样方法的相关研究

4 cDNA-SRAP技术的研究进展

5 importinα3家族的研究进展

5．3 importinα3参与核质转运的分子机制

5．4 importinα3的相关功能研究

6本课题研究的目的与意义

第二章黄鳝粘液中DNA提取方法的建立

1试验材料

1．1试验样品

1．2主要仪器

1．3主要试剂

1．4主要溶液的配置

2试验方法

2．1基因组DNA的提取

2．2粘液和肌肉DNA的检测

2．3黄鳝β-actin引物的扩增

2．4黄鳝18S rRNA引物的扩增

2．5 DNA的回收、纯化克隆和测序

2．6对黄鳝采集粘液后进行成活率统计

3试验结果

3．1提取到的DNA的质量检测

3．2β-actin引物的扩增结果

3．3 18S rRNA基因引物的扩增结果

3．4 DNA的回收、纯化与测序结果

3．5成活率统计结果

4讨论

5小结

第三章黄鳝粘液雌雄差异的cDNA-SRAP分析

1试验材料

1．1试验样品

1．2主要仪器

1．3主要试剂

1．4主要溶液的配置

2试验方法

2．1总RNA的抽提及cDNA的合成

2．3 PCR扩增

2．4电泳及扩增条带的回收和测序

2．5差异条带在雌雄个体中的RT-PCR及荧光定量分析

3试验结果

3．1 cDNA-SRAP引物筛选及扩增图谱

3．2黄鳝性别特征性序列筛选结果

3．3特异片段的雌雄表达差异

3．4特异片段表达的荧光定量分析

4讨论

5小结

第四章importinα3基因的克隆与表达分析

1试验材料

1．1试验样品

1．2主要仪器

1．3主要试剂

1．4主要溶液的配置

2试验方法

2．1总RNA的抽提及cDNA第一链的合成

2．2 importinα3基因克隆相关引物设计

2．3 PCR扩增

2．4序列分析及系统进化树的构建

2．5 importinα3基因的表达水平检测

3试验结果

3．1 importinα3基因全长cDNA的克隆和编码的蛋白序列分析

3．2系统进化分析

3．3 importinα3基因在黄鳝不同成体组织中的表达分析

3．4 importinα3基因在黄鳝胚胎及早期发育阶段中的表达水平

3．5热应激处理后importinα3基因的表达水平

3．6低氧应激后importinα3基因的表达水平

4讨论

5小结

全文总结

参考文献

致谢

科研情况