铁过载对生物节律和血液系统干扰机制的研究

摘要

铁是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素的重要成分并广泛地参与生物体的生长和发育过程,是人体中最重要的金属元素之一。铁主要从食物和饮水中获取,通过尿液、汗液和表皮细胞的脱落排出体外。人体从饮食中吸收的铁多于排出的铁。随着年龄的增长,铁会累积在器官中。铁的过量累积通常伴随着睡眠的紊乱,这些睡眠的变化与老年人的睡眠特征相似。睡眠与生物节律有着密切的关系。随着年龄的增加导致的铁过度累积是否与生物钟基因的表达有关系目前还不清楚,本研究利用基因敲除的遗传工程小鼠来研究这种关系。主要研究内容包括：
　　 ⑴对比分析了8周龄小鼠和64周龄小鼠肝脏中6个生物钟基因Clock、Bmal1、Per1、Per2、Cry1和Cry2的转录,结果显示只有Per2在64周龄小鼠肝脏表达减少了40％,其他的生物钟基因的转录没有削弱。与8周小鼠相比,64周龄小鼠肝脏中铁的含量增加了约50%。喂食6周龄的雄性小鼠含有3%羰基铁的食物2周后,小鼠肝脏中铁含量增加了10倍。检测喂食高铁食物的小鼠肝脏中的生物钟基因的表达,实验发现铁过量累积小鼠的生物钟基因的转录与64周龄小鼠有着相似性,Per2的表达下降了60%,其他的生物钟基因的表达没有减少。右旋糖酐铁注射造成小鼠的铁过载模型也显示铁过载会导致Per2基因转录水平的下降,并呈现出时间和剂量的依赖性。体外实验也进一步证实,FeS04会导致NIH3T3细胞中Per2基因表达水平的下降。这些结果表明随着年龄的增加,食物中的铁在体内累积导致Per2转录水平的下降。
　　 ⑵Per2基因的削弱会导致血小板数目的减少和功能的减弱。比较8-10周龄的野生型小鼠和Per2基因缺失小鼠(Per2-null)的尾部凝血速度,结果显示Per2-null小鼠的平均凝血时间要长1倍,这说明Per2基因缺失会造成凝血能力的下降。对比野生型小鼠和Per2-null小鼠的外周血中血小板的功能,发现Per2-null小鼠的血小板聚集能力下降,血块收缩变慢,分泌能力减弱,血小板中致密颗粒和α颗粒明显减少。分析比较两种基因型小鼠的外周血发现,Per2-null小鼠的血小板数目只有野生型小鼠的一半。将巨核细胞离体培养,结果证实了Per2-null的巨核细胞产生血小板前体的能力明显下降。对两种小鼠的巨核细胞内部结构分析发现,Per2-null小鼠的巨核细胞的数目相对于野生型小鼠没有减少,但是Per2-null小鼠的巨核细胞的分界膜系统发育异常,出现大量的空泡,内部颗粒大量缺失。对巨核细胞的DNA含量及分布研究发现,Per2-null巨核细胞内DNA含量明显增加。由于巨核细胞凋亡的减弱会导致分界膜系统发育异常和DNA含量的大量增加,所以分析对比了野生型小鼠和Per2-null小鼠巨核细胞的凋亡水平,发现Per2-null小鼠的巨核细胞凋亡减少。考察了Tpo和其受体C-mpl的表达水平,发现Tpo和其受体C-mpl在Per2-null小鼠体内表达升高,这些实验结果说明Per2-null小鼠体内Tpo/C-mpl的表达升高可能是由于血小板数目减少导致的代偿性的增强。通过对巨核细胞内凋亡相关的基因转录水平的研究发现,Per2-nuU小鼠的巨核细胞内抗肿瘤基因P53表达减弱,导致下游的抗凋亡基因8cl-2和.Bcl-xL表达升高。这些实验结果表明Per2基因减弱降低了P53转录水平,增强其下游基因Bcl-2和Bcl-xL的表达,减少了巨核细胞的凋亡,导致血小板数目减少和功能的削弱。这些结果与衰老个体的血小板数目的减少是一致的。
　　 ⑶Per2基因的削弱导致红细胞对外界压力敏感度增加。高剂量的盐酸苯肼注射8-10周龄的野生型小鼠和Per2-null小鼠,实验结果发现Per2-null小鼠的致死率明显增加,是野生型小鼠的2倍。用低剂量的盐酸苯肼注射考察红细胞比容的变化,结果表明Per2-null小鼠红细胞比容下降的更明显,说明Per2-null小鼠红细胞受到盐酸苯胼的氧化破坏更严重。体外分离野生型小鼠和Per2-null小鼠的红细胞,在H2O2和低渗压力诱导下,Per2-null小鼠的红细胞溶血率更高,血红蛋白更容易被H2O2诱导生成高铁血红蛋白。由于Per2-null小鼠的红细胞对外界压力敏感导致其更容易被破坏形成溶血,造成了Per2-null小鼠有氧代谢和血液中的氧饱和度的下降,脾脏中红髓明显增加,血清和脾脏中铁含量增加,网织红细胞比例增加,外周血中平均红细胞体积和红细胞分布宽度增大。通过对红细胞形态分析发现,Per2-null小鼠的畸形红细胞数目增加。Per2-null小鼠红细胞中ATP的含量明显下降,细胞膜上ATPase酶活明显的增加,K+离子的浓度明显升高。Per2-null小鼠的骨髓和脾脏中,Na+-K+ATPase的亚基Atplal的表达明显升高。这些结果说明Per2基因的削弱导致Arp1a1的转录水平上升,增强了红细胞膜上ATPasc的活性导致ATP被大量消耗,ATP含量下降,使红细胞对外界压力敏感程度增加,更容易破裂。这些结果与衰老个体的红细胞对外界压力敏感度提高是一致的。以上的结果说明从食物中摄取的铁随着年龄的增加而积累在体内造成生物钟基因Per2转录水平的下降,从而影响机体的生物钟系统和血液系统。这些实验结果提示成年人对铁的摄取应该慎重。