农药中毒后家蚕血液金属蛋白的差异分析及金属离子对其中毒症状的影响

摘要

家蚕是一种重要的经济昆虫，属鳞翅目（Lepidoptera）蚕蛾科（Bombycidae）。辛硫磷是害虫防治中最常用的一种农药，其农药污染严重影响了蚕业经济的发展。金属元素在生物体系中起着重要的作用，在各种金属蛋白和金属酶中承担着重要的生物功能。
　　金属组学是一门旨在研究生物体系内金属元素的分布、化学种态、含量、结构特性、功能等的新兴学科。金属蛋白是含有金属的蛋白，是金属组重要的组成部分，在生物体内中的蛋白质中大约有30％是金属蛋白或者含有金属元素，而这些金属元素中大约有40%参与蛋白的生物学功能。金属蛋白的分离方法主要有液相色法谱和凝胶电泳法，而金属蛋白中金属元素的检测方法主要是借助于高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）和激光烧蚀-电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）。本文分别采用体积排阻色谱和非变性凝胶电泳分离辛硫磷、溴虫腈和氯氰菊酯诱导后的家蚕血液金属蛋白，然后分别结合ICP-MS和 LA-ICP-MS来检测蛋白质中的金属元素。结合上述所测得的金属元素变化对家蚕喂食 FeCl2，CuCl2和 RbCl来改善5龄家蚕的辛硫磷中毒症状；本文的主要内容和结果有以下几个方面：
　　1.采用体积排阻色谱（流动相为30mmol/L Tris-醋酸，PH7.4，流速0.7mL/min，进样量50μm）对辛硫磷、溴虫腈和氯氰菊酯诱导后的5龄家蚕血液蛋白进行分离，然后与 ICP-MS联用测定家蚕金属蛋白中的金属元素。结果显示，在此色谱条件下，家蚕血液蛋白质可以得到很好的分离，农药诱导组与空白组相比蛋白质色谱峰有一定的差异。结合 HPCL-ICP-MS技术对家蚕血液结合金属蛋白的金属元素（Fe、Cu、Zn和 Mn）进行检测，同时比较家蚕血液中的Fe、Cu、Zn和Mn结合金属蛋白在农药诱导下的差异性。实验结果表明，家蚕血液中含有丰富的Fe、Cu、Zn和Mn结合金属蛋白，5龄家蚕在辛硫磷、溴虫腈和氯氰菊酯三种农药诱导下与空白组相比，含有Fe、Zn和Mn的结合金属蛋白含量明显降低，某些Cu结合金属蛋白色谱峰甚至检测不到。
　　2.采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）对家蚕血液蛋白质进行分离，实验在低电流和低温度的条件下进行，然后对凝胶进行考马斯亮蓝染色。结果显示，农药处理后的5龄家蚕血液蛋白与空白组相比有明显的差异性蛋白条带；其中5条蛋白条带比较明显，大部分都是分子量较小的蛋白质。采用 LA-ICP-
　　MS对 PAGE5条差异性条带进行 Mn、Fe、Cu和 Zn元素的测定，结果显示，在 Native-PAGE的5条差异性蛋白条带中，可以检测到含有丰富的金属元素，说明这些条带中含有丰富的金属蛋白。
　　3.采用FeCl2（50 mg/L），CuCl2（150 mg/L），RbCl（0.5 mg/L）喷洒桑叶喂食家蚕的五龄幼虫。辛硫磷处理后48 h，辛硫磷处理组47%的家蚕幼虫出现中毒死亡现象，而FeCl2+辛硫磷组、CuCl2+辛硫磷组和RbCl+辛硫磷组死亡率分别只有27%、32%、22%。结果显示FeCl2，CuCl2和RbCl预处理能够减轻辛硫磷处理下家蚕中毒症状，且能够增强幼虫的存活率；辛硫磷处理后48 h，家蚕血液和脂肪体中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和羧酸酯酶（CarE）活性显著下降，而 FeCl2，CuCl2和 RbCl预处理能够显著减轻辛硫磷诱导的家蚕幼虫血液和脂肪体的SOD、CAT和 CarE活性抑制。CuCl2组SOD活性提高最为明显，FeCl2组 CAT的活性得到了较好的提高，而 FeCl2和RbCl组在提高CarE活性的方面相对CuCl2组效果较好。

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第1章绪论

1.1前言

1.2家蚕辛硫磷中毒相关及抗性酶研究

1.3金属元素对生物体作用的研究

1.4金属蛋白的定性定量方法的研究

1.5本文研究目的及意义

第2章高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用测定家蚕

2.1引言

2.2实验部分

2.3结果与讨论

2.4 本章小结

第3章激光烧蚀-电感耦合等离子体质谱用于家蚕农药中毒后

3.1前言

3.2实验部分

3.3结果与讨论

4.4本章小结

第4章Fe2+、Cu2+、 Rb+对家蚕幼虫辛硫磷中毒症状及相关酶活性的影响

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3结果与分析

4.4本章小结

结论

参考文献

攻读学位与期间发表的学术论文

致谢