骨髓间质干细胞标记及再生肾样细胞的研究

摘要

目的：建立PKH26、DAPI标记骨髓间质干细胞(mesenchymalstem cell，MSC)，的方法，并探讨标记MSC的基本生物学活性；SD大鼠经50％的甘油肌内注射建立大鼠急性肾功能衰竭(acute renalfailure，ARF)模型，评价经尾静脉注射的MSC对大鼠APF的治疗效果及体内外初步探讨其可能机制。 方法: MSC按PKH26、DAPI标记程序进行标记后培养，采用激光共聚焦显微镜(confocol)、流式细胞分析仪(FCM)等观察细胞生长状态和荧光标记活性变化；应用RT-PCR检测标记后MSC的mucleostemin及Bmi-1基因的表达；选用碱性磷酸酶(ALP)染色、von kossa染色及骨形成蛋白3(BMP3)基因表达分析等技术，观察标记后MSC体外分化成骨细胞的特性；SD大鼠经50％的甘油肌内注射建立大鼠ARF模型，尾静脉注射MSC，综合运用临床生物化学、分子生物学、免疫组织化学、病理学、荧光原位杂交(FISH)等技术，评价MSC的治疗效果并找寻修复肾损伤的机制。体外利用Transwell培养板将大鼠MSC与受损肾组织共培养，运用confocol、RT-PCR、巢式PCR、荧光定量PCR鉴定细胞是否能分化为肾小管样上皮细胞，进一步佐证MSC的治疗修复机制。 结果: PKH26标记后细胞呈红色荧光，DAPI标记的细胞核呈蓝色荧光，荧光的强度随着荧光染料浓度的增加而递增，并与传代时间和代数相关；标记后细胞生长状态良好，基本生长特性如传代培养和生长曲线无明显改变；细胞nucleostemin及Bmi-1基因表达未见改变；标记MSC诱导后ALP、Von kossa染色阳性，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征，并表达：BMP3基因；成功建立大鼠ARF模型，ARF大鼠肾组织内具有较多的外源MSC，其他组织如心、肝、肺、脑也可见少量的外源MSC；利用胎儿MSC进行的定位实验中，在大鼠的心、肝及不同肾脏部位扩增出人17α卫星DNA序列。FISH实验显示大鼠冰冻肾脏切片中可见人源性细胞。MSC实验组大鼠血清肌酐、尿素氮下降水平较对照组具有明显的差异(P<0.05)。实验组大鼠肾脏恢复情况较对照组有明显改善。体外共培养后，大鼠MSC形态由长梭形变为圆形，并且高表达上皮细胞特异性基因CK18和肾小管上皮细胞特异性基因AQP1。结论 PKH26、DAPI可稳定标记大鼠骨髓MSC并能传代培养，标记后细胞形态、生长活力及多向分化潜能等无明显影响，该技术可用于追踪MSC转归、可塑性及干细胞移植方面的实验研究；外源MSC体内能够归巢到受损肾脏，并能有效地治疗大鼠ARF。体外受损肾组织能诱导大鼠MSC分化为肾小管样上皮细胞。本研究为ARF的有效治疗和肾损伤的修复等提供新的实验模型和依据，为临床治疗肾脏疾病开辟一条新途径。

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第一章 绪论

1.1干细胞

1.2间质干细胞

1.2.1 MSC的来源

1.2.2 MSC的分离培养方法

1.2.3 MSC的生物学特性

1.2.4 MSC应用的优点

1.3 MSC标记

1.3.1 GFP标记技术

1.3.2荧光原位杂交技术

1.3.3 PKH26标记技术

1.3.4 DAPI标记技术

1.3.5 5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记技术

1.4 MSC可塑性机制和意义

1.4.1 MSC的可塑性

1.4.2 MSC可塑性机制

1.4.3MSC可塑性的意义

1.5 MSC与肾脏疾病

1.5.1 MSC在肾脏疾病中的作用

1.5.2 MSC作为转基因载体治疗肾脏疾病

1.5.3 MSC移植治疗的机制及存在的问题

1.6 MSC临床应用展望

第二章研究目的、方法、实验设计方案和意义

2.1研究目的

2.2研究方法

2.3实验设计方案

2.4研究意义

第三章PKH26、DAPI标记大鼠骨髓间质干细胞的实验研究

3.1试剂与仪器

3.1.1主要试剂

3.1.2主要仪器

3.2 方法

3.2.1 MSC的分离和培养

3.2.2 PKH26、DAPI标记MSC

3.2.3细胞动力学检测

3.2.4流式细胞分析

3.2.5诱导标记MSC分化成骨细胞及细胞化学染色

3.2.6 RT-PCR

3.3结果

3.3.1 MSC形态学特点

3.3.2染色结果

3.3.3细胞动力学检测

3.3.4标记MSC传代特征

3.3.5诱导成骨细胞的ALP染色和Von Kossa染色

3.3.6 Nucleostemin，Bmi-1和BMP3基因表达

3.4 讨论

第四章骨髓间质干细胞在大鼠急性肾功能衰竭中的作用研究

4.1材料和方法

4.1.1材料

4.1.2主要试剂

4.1.3主要仪器

4.1.4方法

4.2 结果

4.2.1 MSC分离和培养

4.2.2大鼠ARF模型建立

4.2.3 DAPI标记的大鼠MSC在ARF大鼠体内定位实验

4.2.4胎儿MSC在ARF大鼠体内定位实验

4.2.5治疗效果

4.2.6治疗机制

4.3 讨论

第五章体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为肾小管样上皮细胞的研究

5.1材料和方法

5.1.1材料

5.1.2主要试剂

5.1.3主要仪器

5.1.4方法

5.2 结果

5.2.1大鼠MSC的分离和培养

5.2.2大鼠ARF模型建立

5.2.3共培养后细胞形态学变化

5.2.4共培养后细胞肾小管上皮细胞特异性基因表达变化

5.2.5荧光定量PCR鉴定共培养后细胞CK18表达

5.3 讨论

结论及展望

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间获奖及发表的学术论文