Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶对胃癌细胞增殖、迁移等生物学活性的影响

摘要

研究目的：研究Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶(cGMP dependent protein kinaseⅡ，PKGⅡ)对人胃癌细胞增殖、迁移等生物学活性的影响。
　　 研究方法：
　　 (1)利用293A细胞扩增重组腺病毒载体Ad-PKGⅡ及空载体Ad-LacZ，感染人胃癌细胞AGS、BGC-823、SGC-7901，用X-gaL染色和Western blotting方法检测重组腺病毒对胃癌细胞的感染效率及感染后目的蛋白的表达。选择对重组腺病毒敏感的胃癌细胞株进行后续实验。
　　 (2)以特异性激活PKGⅡ的cGMP类似物8-pCPT-cGMP作用感染或未感染的胃癌细胞，激活PKGⅡ，通过MTr试验、BrdU掺入实验、增殖细胞核抗原(PCNA)的检测，分析PKGⅡ对人胃癌细胞增殖的影响；用流式细胞术检测PKGⅡ对细胞周期过程的影响。
　　 (3)DNA琼脂糖凝胶电泳对DNA梯状条带分析及流式细胞术检测高表达和活性增高的PKGⅡ对人胃癌细胞凋亡的影响。
　　 (4)通过Boyden槽迁移率分析法、刮除-迁移分析法和软琼脂培养、裸鼠携瘤实验，观察高表达和活性增高的PKGⅡ对人胃癌细胞BGC-823迁移和致瘤性的影响。
　　 研究结果：
　　 (1)扩增、鉴定重组腺病毒载体Ad-PKGⅡ和Ad-LacZ并感染胃癌细胞株，X-gaL染色和Western blotting结果表明，BGC-823对腺病毒最为敏感，在MOI=100时，感染效率为97±18％，且持续高表达PKGⅡ蛋白。BGC-823细胞具有较强的增殖和迁移能力，所以选择其为实验细胞株。
　　 (2)PKGⅡ在胃癌细胞高表达和活性增高可以有效抑制细胞生长，使单个细胞DNA合成减少，对EGF引起的PCNA表达增高具有明显的抑制作用，并可使大量细胞阻滞于G1期，S期细胞减少，表明活化的PKGⅡ可以有效抑制细胞的增殖和周期的进程。
　　 (3)流式细胞术及DNA琼脂糖凝胶电泳分析发现，高表达和活化的PKGⅡ对胃癌细胞的凋亡没有明显的影响。
　　 (4)PKGⅡ高表达和活性增高可以有效抑制人胃癌细胞BGC-823的迁移活动，减弱细胞附着非依赖性生长和抑制细胞在裸鼠体内的成瘤。
　　 结论：
　　 PKGⅡ在胃癌细胞为低表达，感染重组腺病毒载体Ad-PKGⅡ后表达增高，以特异性激活PKGⅡ的cGMP类似物8-pCPT-cGMP作用后，可以有效抑制胃癌细胞BGC-823的增殖、迁移等生物学活性，而对细胞凋亡没有明显的影响。证实PKGⅡ为一个潜在的抑癌因子。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写索引

声明

第一章绪论

1.1.PKG的研究背景

1.1.1.PKG的分类，分布

1.1.2.PKG的结构

1.1.3.PKG的活性调节

1.1.4.PKG上下游信号分子和信号通路

1.1.5.PKG Ⅰ的主要功能及其与肿瘤的联系

1.1.6.PKG Ⅱ的主要功能及其与肿瘤的联系

1.2.本论文研究的目的、内容、意义、方法、实验方案的设计

1.2.1研究目的：

1.2.2研究内容：

1.2.3研究意义：

1.2.4研究方法及技术：

1.2.5实验方案的设计：

第二章Ⅱ型PKG重组腺病毒载体的扩增及鉴定

2.1材料和方法

2.1.1材料

2.1.2实验方法

2.2实验结果

2.2.1.重组腺病毒的扩增及滴度测定

2.2.2.重组腺病毒Ad-LacZ对细胞感染效率的测定

2.2.3.重组腺病毒载体携带的目的基因在胃癌细胞中持续表达

2.3讨论

第三章Ⅱ型PKG对胃癌细胞增殖及凋亡的影响

3.1材料和方法

3.1.1材料

3.1.2实验方法

3.2结果

3.2.1 PKG Ⅱ对BGC-823细胞增殖的影响

3.2.2 PKG Ⅱ抑制单细胞DNA的合成

3.2.3增殖细胞核抗原(PCNA)表达

3.2.4细胞周期的变化

3.2.5细胞凋亡

3.3讨论

第四章Ⅱ型PKG对胃癌细胞迁移及致瘤性的影响

4.1材料和方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2实验结果

4.2.1 PKG Ⅱ对RhoA活性的抑制作用

4.2.2 PKG Ⅱ抑制细胞迁移

4.2.3 PKG Ⅱ抑制胃癌细胞克隆形成

4.2.4裸鼠荷瘤实验

4.3讨论

第五章主要结论和展望

5.1主要结论

5.2展望

致 谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的文章