荧光假单胞菌AR4膜结合葡萄糖脱氢酶的分离纯化及其性质研究

摘要

膜结合吡咯喹啉醌依赖的葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase，PQQ-GDH，EC1.1.5.2)是食品添加剂D-异抗坏血酸及其钠盐的合成前体2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid，2KGA)生物合成过程中的关键酶。
　　本论文对国内2KGA工业生产用菌荧光假单胞菌AR4的膜结合PQQ-GDH进行了分离纯化和鉴定，系统研究了PQQ-GDH的酶学性质，并初步开展了酶促反应动力学的研究，为2KGA高效生产菌株的构建提供一定的理论依据。
　　主要结论如下:
　　(1)经过超声破碎细胞、Triton X-114两相分离、丙酮沉淀、聚乙二醇6000沉淀、乙醇沉淀以及Hydroxyapatite Fast Flow层析等6个步骤分离纯化，获得了比活为14.6 U/mg、纯化倍数达76.7倍的荧光假单胞菌AR4的膜结合PQQ-GDH。
　　(2) SDS-PAGE电泳分析结果表明，荧光假单胞菌AR4的膜结合PQQ-GDH是单体蛋白，只有一个亚基，相对分子质量为90 kDa左右。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析结果证明，从荧光假单胞菌AR4分离纯化的蛋白质确实为膜结合的PQQ依赖的GDH，相对分子质量87kDa左右。
　　(3)酶学性质研究结果表明，荧光假单胞菌AR4的膜结合PQQ-GDH的最适反应pH值为6.0，最适反应温度为35℃，在pH3.0～6.0、15～35℃具有较好的稳定性，在含有20％甘油的磷酸盐缓冲液(pH=6.0)中，荧光假单胞菌AR4膜结合PQQ-GDH的稳定性较高;Mg2+对膜结合PQQ-GDH具有促进作用，Zn2+在10mmol/L对PQQ-GDH具有促进作用，但高于50mmol/L时具有很强的抑制作用;Cu2+、Fe3+、Mn2+、一些常用的有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮和正己烷）、等对该酶具有不同程度的抑制作用;EDTA对膜结合PQQ-GDH的影响具有明显的抑制作用，说明该酶属于金属酶;膜结合PQQ-GDH具有广泛的底物特异性，可以以D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-木糖和D-半乳糖为底物，但是不能以蔗糖、D-果糖和D-葡萄糖酸钠作为底物，D-葡萄糖为最适底物;辅因子（辅基）PQQ与酶蛋白的结合是紧密的。
　　(4)以DCIP-PMS为电子受体，以D-葡萄糖为底物，25℃、pH6.0的条件下，荧光假单胞菌AR4膜结合PQQ-GDH的酶促反应的最大反应速率Vmax为15.552μmol/mg·min，Km为0.040 mol/L;当底物为D-木糖时，膜结合PQQ-GDH酶促反应的最大反应速率Vmax为4.515μmol/mg·min，Km为0.450 mol/L;当底物为D-半乳糖时，膜结合PQQ-GDH的最大反应速率Vmax为5.131μmol/mg·min，Km为0.104 mol/L;当底物为D-麦芽糖时，膜结合PQQ-GDH的最大反应速率Vmax为3.540μmol/mg·min, Km为0.297 mol/L。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 蛋白质(酶)的分离纯化

1．1．1 凝胶过滤层析

1．1．2 离子交换层析

1．1．3 亲和层析

1．1．4 反胶束溶剂法

1．1．5 双水相技术

1．1．6 泡沫分离技术

1．1．7 电泳技术

1．1．8 多种方法相结合

1．2 Triton X-114两相分离法提取内在膜蛋白

1．2．1 原理

1．2．2 Triton X-114两相分离方法

1．3 2-酮基-D-葡萄糖酸概述

1．3．1 2-酮基-D-葡萄糖酸的理化性质

1．3．2 2-酮基-D-葡萄糖酸的用途

1．3．3 2-酮基-D-葡萄糖酸的生产方法及生物合成途径

1．4 膜结合吡咯喹啉醌依赖的葡萄糖脱氢酶

1．4．1 PQQ

1．4．2 PQQ-GDH的来源

1．4．3 PQQ-GDH的分类

1．4．4 膜结合PQQ-GDH

1．4．5 膜结合PQQ-GDH底物谱

1．4．6 国外对膜结合葡萄糖脱氢酶的分离纯化的研究

1．5 立题意义

1．6 研究的主要内容

第二章 荧光假单胞菌AR4膜结合葡萄糖脱氢酶粗酶液的制备条件优化

2．1 实验材料

2．1．1 菌种

2．1．2 培养基

2．1．3 实验试剂与仪器

2．2 实验方法

2．2．1 斜面培养

2．2．2 菌种扩大培养

2．2．3 菌体细胞的收集

2．2．4 细胞的超声破碎

2．2．5 pH值的测定

2．2．6 培养液中菌体生长量(OD650nm值)的测定

2．2．7 D-葡萄糖的测定

2．2．8 2KGA的测定

2．2．9 蛋白质的测定

2．2．10 不同温度下电子受体DCIP毫摩尔消光系数的测定

2．2．11 不同pH下电子受体DCIP的毫摩尔消光系数的测定

2．2．12 PQQ-GDH活性的测定

2．3 结果与讨论

2．3．1 不同温度下电子受体DCIP的毫摩尔消光系数

2．3．2 不同pH下电子受体DCIP的毫摩尔消光系数

2．3．3 荧光假单胞菌AR4的培养过程

2．3．4 培养时间对荧光假单胞菌AR4膜结合PQQ-GDH活性的影响

2．3．5 细胞超声破碎条件的优化

2．4 本章小结

第三章 荧光假单胞菌AR4膜结合葡萄糖脱氢酶的分离纯化及鉴定

3．1 实验材料

3．1．1 菌种

3．1．2 培养基

3．1．3 主要试剂与材料

3．1．4 主要仪器与设备

3．2 实验方法

3．2．1 菌体扩大培养及收集

3．2．2 细胞的超声破碎

3．2．3 粗酶液的收集

3．2．4 两相分离

3．2．5 丙酮沉淀

3．2．6 沉淀溶解

3．2．7 聚乙二醇沉淀

3．2．8 乙醇沉淀

3．2．9 Hydroxyapatite Fast Flow层析

3．2．10 GDH酶活测定

3．2．11 蛋白浓度测定

3．2．12 聚丙烯酰胺凝胶电泳

3．2．13 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 丙酮沉淀对PQQ-GDH提取的影响

3．4．2 Hydroxyapatite Fast Flow吸附层析

3．4．3 荧光假单胞菌AR4的GDH纯化结果

3．4．4 荧光假单胞菌AR4的PQQ-GDH的鉴定

3．5 本章小结

第四章 荧光假单胞菌AR4膜结合葡萄糖脱氢酶的酶学性质研究

4．1 实验试剂与材料

4．1．1 实验试剂

4．1．2 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 PQQ-GDH最适反应pH值与pH稳定性的测定

4．2．2 PQQ-GDH最适反应温度与热稳定性的测定

4．2．3 金属离子对PQQ-GDH活性的影响

4．2．4 有机溶剂对酶的稳定性影响

4．2．5 PQQ-GDH的底物特异性

4．2．6 常温保存与长期保存对PQQ-GDH活性的影响

4．2．7 金属螯合剂EDTA对酶活性的影响

4．2．8 PQQ与NAD对PQQ-GDH的酶促反应速率的影响

4．2．9 单底物的酶促反应动力学

4．3 结果与分析

4．3．1 PQQ-GDH的最适反应pH位以及pH稳定性

4．3．2 PQQ-GDH的最适反应温度与热稳定性

4．3．3 金属离子对PQQ-GDH活性的影响

4．3．4 有机溶剂对PQQ-GDH活性的影响

4．3．5 PQQ-GDH的底物特异性

4．3．6 常温保存与长期保存对PQQ-GDH活性的影响

4．3．7 金属螯合剂EDTA对酶活性的影响

4．3．8 PQQ与NAD对PQQ-GDH的酶促反应速率的影响

4．3．9 单底物的酶促反应动力学

4．4 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 全文主要结论

5．2 展望

参考文献

致谢

在攻读硕士学位期间发表的论文