道地丹皮防治糖尿病肾病优效性物质基础的独特组分结构特征密码探究

摘要

道地药材是中医药临床运用瑰宝，在防病治病的过程中扮演着不可或缺的角色。道地药材，质量佳、疗效好，其根本原因的不是存在某些独特成分，大部分情况下也不是某一成分含量越高越好，而是内在的化学成分/组分之间存在的独特“组分结构特征”密码。这种特征密码是道地药材不同于非道地药材的本质区别，也是防病治病疗效差异的本质因素。因此，揭示内在的密码特征，是科学阐述道地药材优效性的前提，也是临床防治疾病的科学依据。
　　牡丹皮是传统中药配方中常见的草药之一，具有显著对抗糖尿病肾病活性。目前市场上流通的丹皮产地繁多，不同产地的丹皮功效良莠不齐，这种差异在于内在的组成结构密码特征不一致。“组分结构理论”认为，道地药材的物质基础即由各个组分构成，其间具有稳定的组成结构密码特征;组分内的各活性成分之间同样具有稳定的组成结构密码特征;而单独的活性单体，自身依旧具有独特的三维结构密码特征。本课题基于中医药整体观及“组分结构理论”，通过对道地和非道地丹皮药效、成分的比较，结合细胞膜固相色谱技术对丹皮抗糖尿病肾病整体效应物质进行快速辨识研究，深入地揭示道地丹皮内在的独特组成结构密码特征，初步为道地丹皮防治糖尿病肾病的优效性提供物质基础本质依据。主要内容包括以下几个部分:
　　1.道地丹皮药材防治糖尿病肾病活性评价
　　本章基于非酶糖基化学说，研究丹皮防治糖尿病肾病的一系列药理效应，包括其对基底膜增厚、氧化应激、炎症等的影响。
　　(1)抗基底膜增厚:建立体外细胞模型，通过MTT法、酶联免疫吸附实验等研究丹皮对系膜细胞的增殖以及基底膜增厚的影响。结果表明道地丹皮能抑制AGEs刺激的细胞增殖，减少FN和ColⅣ分泌、下调FN蛋白表达和ColⅣ的mRNA表达。说明道地丹皮能明显抑制ColⅣ及FN的合成，改变基底膜增厚的特征。
　　(2)抗氧化作用:道地丹皮的总抗氧化能力由ABTS法测定，IC50:0.19 g/mL。以细胞内ROS为指标，发现当AGEs刺激后，红色荧光显著增强，不同浓度丹皮作用后，ROS含量有显著的改善。利用体外细胞实验和体内动物实验，分别从SOD、CAT、MDA和GSH-Px的水平反应道地丹皮的抗氧化水平，结果表明丹皮能较好的抑制氧化应激作用。
　　(3)抗炎作用:以巨噬细胞穿透能力、细胞上清与大鼠血清IL-6和MCP-1含量，大鼠肾脏炎症蛋白表达、细胞内炎症蛋白表达、RAGE受体表达为指标，发现丹皮能有效降低巨噬细胞穿透能力、IL-6、MCP-1、ICAM-1、TGF-β1等炎症蛋白表达。研究结果表明道地丹皮能有效地对抗AGEs诱导的炎症反应。
　　通过研究发现，道地丹皮能够抑制基底膜增厚、减弱氧化应激和炎症反应，因而，其具有较好的抗糖尿病肾病作用。
　　2.道地丹皮抗糖尿病肾病优效性研究
　　目前市场上流通的丹皮产地众多，为选用抗糖尿病肾病的优效性丹皮，本章对不同产地的丹皮进行药效对比研究。主要采用细胞内ICAM-1、TGF-β1和FN的表达研究不同产地丹皮体外效应;采用测定大鼠血糖，24h尿蛋白和血肌酐水平、血清内CAT和GSH-Px活力变化、肾脏ICAM-1、TGF-β1的表达研究不同产地丹皮体内效应;通过聚类分析进行药效归类比较。结果表明传统安徽铜陵所产道地丹皮具有更优的抗糖尿病肾病疗效，贵州、浙江、河南丹皮与安徽丹皮药效相似性较高归为一大类，在药效上不存在较明显的差异;湖南、河北、重庆、甘肃、四川、山东归为一类，具有药效显著性差异。
　　3.道地丹皮抗糖尿病肾病整体效应物质基础组分辨识和解析
　　为揭示道地丹皮效应的物质基础，本章通过细胞膜固相色谱、血小板固相色谱、体外AGEs生成的非酶糖基化体系对道地丹皮的抗糖尿病肾病整体效应物质基础组分进行辨识。
　　(1)建立细胞膜固相筛选系统，并通过LC/ESI/MS/MS技术寻找、辨别和归属效应物质标志峰，通过不同时间、不同浓度的对比，确定条件为:2×10-4 mg/mL丹皮与系膜细胞共孵育90min。最终发现发现丹皮中有8个物质为细胞膜固相活性产物，这些物质可能是道地丹皮抑制系膜细胞损伤、防治糖尿病肾病的主要活性化合物，分别是牡丹苷B、芍药苷亚硫酸酯、芍药苷、四没食子酰葡萄糖（同分异构）、六没食子酰葡萄糖、牡丹皮苷A、丹皮酚。
　　(2)建立体外AGEs生成的非酶糖基化系统，并通过LC/ESI/MS/MS技术寻找、辨别和归属效应物质标志峰。发现丹皮提取物与丙酮醛反应后，有色谱峰消失或减少，也有色谱峰增加，这些物质分别是三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖、没食子酰芍药苷、六没食子酰葡萄糖和苯甲酰芍药苷。
　　(3)建立血小板固相色谱系统，通过LC/ESI/MS/MS技术寻找、辨别和归属效应物质标志峰。发现丹皮提取物与血小板反应后，有4个成分存在于解离液中，发挥效应。筛选出的活性物质分别为氧化芍药苷、四没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖和苯甲酰芍药苷。
　　最终发现道地丹皮抗糖尿病肾病物质基础整体构成的13种成分，即牡丹苷B、芍药苷亚硫酸酯、氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖（同分异构）、五没食子酰葡萄糖、六没食子酰葡萄糖、没食子酰芍药苷、苯甲酰芍药苷、牡丹皮苷A和丹皮酚，主要属于总苷/酚和鞣质组分。
　　4.道地丹皮组成结构特征密码探究及其优化
　　前期研究结果证实道地丹皮发挥抗糖尿病肾病的整体效应物质为总苷/酚和鞣质组分，结合文献报道的多糖组分，本章主要对道地丹皮进行组分分离富集及其组成结构特征密码优化。
　　(1)通过对总苷/酚、鞣质、多糖组分共同采取现代分离、分析技术，进行分离富集，获得组分群。通过比较了5种大孔树脂的吸附、解吸附性能，筛选出D101型大孔树脂用于丹皮总苷/酚的分离纯化;通过比较明胶的浓度和用量、丙酮的浓度，筛选出鞣质分离的方法;通过脱蛋白、透析除去小分子纯化丹皮多糖。最终获得的总苷/酚、鞣质、多糖组分得率分别为2.89％、0.74％、1.9％，组分构成特征密码为5.78∶1.48∶3.8。
　　(2)通过SOD活性、MDA、IL-6及MCP-1含量测定，对总苷/酚、鞣质、多糖组分的组成结构特征密码进行优化设计，结果表明，当总苷/酚、多糖、鞣质的组成结构特征密码在5.78∶3.8∶(2.96～4.44)时，具有更优的药效。
　　(3)经过HPLC分析及道地丹皮整体色谱的研究，丹皮组分内13个活性物质按照一定的组成结构特征密码存在于药材中，对牡丹苷B、芍药苷亚硫酸酯、氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖（同分异构）、五没食子酰葡萄糖、六没食子酰葡萄糖、没食子酰芍药苷、苯甲酰芍药苷、牡丹皮苷A和丹皮酚的峰面积进行构成研究，发现其组成结构特征密码为1∶0.2∶1.4∶10.4∶0.5∶0.6∶0.6∶2.7∶1.1∶0.7∶1.0∶1.1∶14.9。
　　5.道地和非道地丹皮抗糖尿病肾病优效性差异的组成结构特征密码解析
　　前阶段研究表明河北非道地丹皮与安徽道地丹皮药效差异较显著，为研究其差异的本质，本章对道地与非道地丹皮的药效成分的组成结构特征密码进行差异比较（多糖组分未作组分内构成研究，在此不做讨论），并对非道地丹皮进行组成结构特征密码改造，研究道地丹皮优效性的物质基础本质的组成结构特征密码。
　　(1)结合峰面积对10个产地丹皮药效成分聚类分析，对13个物质进行归属，发现浙江、河南、安徽为一类，具有相同的组成结构特征密码。河北产地丹皮药材为一类，成分构成与安徽道地丹皮药效组分构成差异明显，对其峰面积进行组成结构特征研究，发现其自身特征的组成结构密码为1∶0.5∶14.2∶16.5∶0.4∶0.8∶2.2∶2.4∶0.4∶1.7∶1.3∶1.1∶18.7。基于主成分分析和实验室基础，优选了6个成分进行组成结构实验研究，分别为氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚，确定道地丹皮和非道地河北丹皮这6种优选成分的组成结构密码构成为1∶7.5∶0.3∶0.4∶0.7∶10.7和1∶1.2∶0.03∶0.03∶0.1∶1.3。
　　(2)对药效及成分构成与安徽道地丹皮相差较大的河北丹皮进行优选成分组成结构特征密码构成改造，将河北丹皮6种化学成分氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚进行构成研究:从自身的组成结构特征密码1∶1.2∶0.03∶0.03∶0.1∶1.3调整为与安徽丹皮相似的1∶7.5∶0.3∶0.4∶0.7∶10.7。结果表明组成结构特征密码改造后的河北丹皮药效优于本身构成，与安徽道地丹皮药效接近。
　　6.总结
　　本研究基于“组分结构理论”，通过对道地和非道地丹皮药效、成分的比较，结合丹皮抗糖尿病肾病整体效应物质进行快速辨识研究，揭示了道地丹皮防治糖尿病肾病优效性物质基础的独特组分结构特征密码。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 研究目的与意义

1．1．1 研究意义

1．1．2 研究目的

1．2 中医药防治糖尿病肾病物质基础研究及“组分结构理论”假说

1．2．1 中药(复方)物质基础研究现状

1．2．2 中医药防治糖尿病肾病物质基础研究

1．2．3 中药三个层次多维结构“组分结构理论”假说

1．3 药材道地性研究及其“组分结构”本质提出

1．3．1 道地药材成因浅析

1．3．2 传统道地药材研究及评估

1．3．3 基于“组分结构理论”的道地药材研究新思路

1．4 基于非酶糖基化学说的糖尿病肾病研究

1．4．1 糖尿病肾病研究现状

1．4．2 非酶糖基化学说

1．4．3 非酶糖基化终末产物与糖尿病肾病

1．4．4 以非酶糖基化为靶点的药物研究

1．5 生物色谱筛选中药活性物质

1．6 牡丹皮防治糖尿病肾病研究

1．6．1 丹皮化学成分研究

1．6．2 丹皮防治糖尿病肾病药理研究

1．6．3 丹皮对抗AGEs引发的糖尿病肾病研究

第二章 道地丹皮药材防治糖尿病肾病活性评价

2．1 道地丹皮防治糖尿病肾病模型的建立

2．1．1 糖尿病肾病大鼠模型的建立

2．1．2 AGEs诱导的HBZY-1细胞模型的建立

2．2 道地丹皮对AGEs诱导的系膜细胞增殖及基底膜增厚的影响

2．2．1 道地丹皮对AGEs诱导的系膜细胞增殖的影响

2．2．2 道地丹皮对AGEs诱导的纤维连接蛋白(FN)生成的影响

2．2．3 道地丹皮对AGEs诱导的Ⅳ胶原蛋白(Col Ⅳ)生成的影响

2．2．4 本节小结

2．3 道地丹皮对AGEs诱导的氧化应激的影响

2．3．1 道地丹皮总抗氧化能力(ABTS法)活性评价

2．3．2 道地丹皮对AGEs诱导的细胞中活性氧(ROS)的影响

2．3．3 道地丹皮对AGEs诱导的细胞上清和大鼠血清中CAT和GSH-Px活力的影响

2．3．4 道地丹皮对AGEs诱导的细胞上清和大鼠血清中SOD和MDA含量的影响

2．3．5 本节小结

2．4 道地丹皮对抗AGEs诱导的炎症反应的活性评估

2．4．1 道地丹皮对AGEs诱导的巨噬细胞穿透能力的影响

2．4．2 道地丹皮对AGEs诱导的细胞上清和大鼠血清中IL-6和MCP-1含量的影响

2．4．3 道地丹皮对AGEs诱导的大鼠肾脏炎症蛋白表达的影响

2．4．4 道地丹皮对AGEs诱导的系膜细胞内炎症蛋白表达和作用机制的影响

2．4．5 本节小结

2．5 本章小结

第三章 道地丹皮抗糖尿病肾病优效性研究

3．1 药材鉴定与处理

3．1．1 药材的鉴定

3．1．2 药材的处理

3．2 不同产地丹皮体外药效研究

3．2．1 体外模型的建立

3．2．2 实验分组、给药方法的建立

3．2．3 各组细胞上清CAT和GSH-Px活力的影响

3．2．4 各组HBZY-1细胞内ICAM-1、TGF-β1和FN表达的比较

3．2．5 本节小结

3．3 不同产地丹皮体内药效研究

3．3．1 体内模型的建立

3．3．2 实验分组、给药方法的建立

3．3．3 各组大鼠糖尿病肾病特征性指标的比较

3．3．4 各组大鼠血清CAT、GSH-Px的比较

3．3．5 各组大鼠肾脏组织中ICAM-1、TGF-β1表达的比较

3．3．6 本节小结

3．4 药效聚类分析

3．5 本章小结

第四章 道地丹皮抗糖尿病肾病整体效应物质基础组分的辨识和解析

4．1 细胞膜固相色谱活性成分筛选

4．1．1 细胞固相筛选体系的构建

4．1．2 不同浓度丹皮对固相成分的影响

4．1．3 不同时间对固相成分的影响

4．1．4 细胞膜固相丹皮产物检测

4．1．5 LC／ESI／MS／MS辨别固相活性成分归属

4．1．6 本节小结

4．2 抑制AGEs生成的活性成分筛选

4．2．1 体外AGEs生成的非酶糖基化系统的建立

4．2．2 捕捉羰基化合物活性物质辨识和检测

4．2．3 LC／ESI／MS／MS辨别抑制AGEs生成活性成分归属

4．2．4 本节小结

4．3 抑制AGEs诱导的血小板凝集活性成分筛选

4．3．1 血小板固相色谱法的建立

4．3．2 抑制血小板聚集的活性物质检测

4．3．3 LC／ESI／MS／MS辨别抑制血小板凝集活性成分归属

4．3．4 本节小结

4．4 本章小结

第五章 道地丹皮组成结构特征密码探究和优化

5．1 活性组分的分离富集及其构成研究

5．1．1 总苷／酚组分的分离富集纯化研究

5．1．2 鞣质组分的分离富集研究

5．1．3 多糖组分的分离纯化研究

5．1．4 本节小结

5．2 丹皮活性组分药效及组成结构特征密码优化的研究

5．2．1 各组分对AGEs诱导的糖尿病肾病药效研究

5．2．2 道地丹皮抗糖尿病肾病组分的构成优化研究

5．2．3 本节小结

5．3 组分内部有效成分组成结构特征研究

5．3．1 仪器与试药

5．3．2 色谱条件

5．3．3 溶液制备

5．3．4 结果与讨论

5．3．5 本节小结

5．4 本章小结

第六章 道地和非道地丹皮抗糖尿病肾病优效性差异的组成结构特征密码解析

6．1 丹皮属药材化学成分比较

6．1．1 不同产地丹皮性状比较

6．1．2 不同产地丹皮提取得率比较

6．1．3 不同产地丹皮药材HPLC分析比较

6．1．4 本节小结

6．2 丹皮属药材组分内构成研究

6．2．1 LC／ESI／MS／MS辨别丹皮属药效活性成分归属

6．2．2 药效成分峰面积聚类分析

6．2．3 本节小结

6．3 丹皮药材组成结构成分的优选及活性评估

6．3．1 主成分分析法优选丹皮属药材组成结构成分

6．3．2 组成结构优选成分的活性评估

6．3．3 本节小结

6．4 道地丹皮优效性的组成结构特征密码本质解析

6．4．1 道地和河北非道地丹皮6种优选成分组成结构特征研究

6．4．2 河北非道地丹皮优选成分组成结构改造

6．4．3 本节小结

6．5 本章小结

第七章 总结与展望

7．1 研究创新点

7．2 主要结论

7．2．1 道地丹皮药材防治糖尿病肾病活性及优效性评价

7．2．2 道地丹皮抗糖尿病肾病整体效应物质基础组分辨识和解析

7．2．3 道地丹皮组成结构特征密码探究及其优化

7．2．4 道地丹皮组分内成分结构特征密码研究

7．2．5 道地和非道地丹皮优效性差异的组成结构特征密码本质

7．3 工作展望

参考文献

硕士在读期间相关论文

致谢