强力霉素保护小鼠胸腺上皮细胞系(MTEC1)抵抗细胞凋亡机制的研究及强力霉素多克隆抗体的制备

摘要

第一部分
　　目的:本研究主要通过丝裂霉素C(Mitomycin C，MMC)体外诱导胸腺上皮细胞系（Mouse thymic epithelial cells line1，MTEC1）凋亡，来研究强力霉素(Doxycycline，Dox)保护MTEC1细胞，抵抗凋亡的分子机制。为强力霉素应用于老年性免疫缺陷、严重感染(HIV)和移植排斥反应所引起的T细胞免疫缺陷的重建奠定实验室研究基础。
　　方法:不同浓度Dox、MMC和Dox+MMC处理MTEC1不同时间后，采用CCK-8法、Hoechst33342染色、流式细胞术和Western Blot技术综合分析Dox保护MTEC1抵抗MMC诱导的细胞凋亡现象和机制。
　　结果:本研究发现Dox具有保护MTEC1抵抗MMC诱导的细胞凋亡的现象;进一步通过Western Blot检测相关蛋白发现Dox抗凋亡的机制为上调Trx2，p-NF-κB，Bcl-2表达，而下调Bax的表达。
　　结论:本研究首次揭示了Dox通过Trx2途径保护MTEC1抵抗MMC诱导的细胞凋亡，为今后临床研究Dox保护胸腺上皮细胞，促进T细胞的重建提供实验室依据。
　　第二部分
　　目的:本实验采用人工偶联方法构建Dox完全抗原，制备多克隆抗体，为今后研究强力霉素作用靶点及机制奠定基础。
　　方法:分别采用直接偶联法、甲醛一步法、重氮法+混合酸酐法和重氮法+碳二亚胺法等四种方法将Dox与BSA/OVA分别进行偶联，构建为完全人工抗原。对偶联产物采用紫外分光光度计进行波峰扫描，根据其波峰的移动，判断其偶联效果，并计算偶联比率。选择效果最好的偶联方法大量制备抗原，并用于免疫BALB/c小鼠，通过直接ELISA的方法检测多克隆抗体效价，用竞争抑制ELISA的方法分析其灵敏性及特异性。
　　结果:通过重氮法+碳二亚胺法偶联的Dox人工完全抗原效果最好，经计算其与BSA的偶联比为8.37∶1，与OVA的偶联比为4.92∶1。采用该方法偶联的抗原免疫小鼠获得的多抗效价在1∶8000以上，该抗体对Dox的半数抑制浓度(IC50)在98.89～120.32μg/L之间，抗体与其他四环素类药物的交叉反应性较低。
　　结论:重氮法+碳二亚胺法进行的偶联效率最高，并获得了效价较高、特异性和灵敏度均比较理想的Dox多克隆抗体。

目录

声明

摘要

第一部分 强力霉素保护小鼠胸腺上皮细胞系(MTEC1)抵抗细胞凋亡机制的研究

第一章 绪论

1．1 四环素及其衍生物的非抗生素作用

1．2 几种细胞凋亡相关蛋白的介绍

第二章 研究目的、内容、方法、实验设计方案和意义

2．1 研究目的

2．2 研究内容

2．3 研究方法

2．4 实验设计方案

2．5 研究意义

第三章 Dox保护MTEC1抵抗细胞凋亡机制的研究

3．1 材料与仪器

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

第四章 主要结论及展望

4．1 主要结论

4．2 展望

第二部分 Dox多克隆抗体的制备

第一章 绪论

1．1 Dox及其它四环素类药物的化学结构和性质

1．2 四环素类抗生素的抗菌机制

1．3 Dox抗体研究现状

第二章 研究目的、内容、方法、实验设计方案和意义

2．1 研究目的

2．2 研究方法与内容

2．3 实验设计方案

2．4 本研究的意义

第三章 Dox多克隆抗体的制备与鉴定

3．1 仪器与材科

3．2 实验方法

3．5 实验结果与分析

3．5 讨论

第四章 主要结论及展望

4．1 主要结论

4．2 展望

参考文献

缩略表

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章及参加的会议